同时提高蛋白质结晶成功率及晶体质量的方法技术

本发明专利技术涉及一种同时提高蛋白质结晶成功率及晶体质量的方法，用于解决现有的蛋白质结晶方法难以同时提高结晶成功率和晶体质量的技术问题。技术方案是利用对蛋白质具有吸附-解吸附功能的吸附材料，在结晶溶液中同时形成两个浓度区域，在吸附材料附近的高浓度区，及远离吸附材料的低浓度区。从而同时达到高浓度条件促使蛋白形核，低浓度条件促使蛋白晶体生长。将吸附材料置于溶液内的上方位置，晶体在上方形核，起到提高结晶成功率的作用。而当晶体长大到数微米尺度时，因重力作用，沉降到溶液内下方位置，该位置溶液浓度低，在提高蛋白质结晶质量的同时，蛋白质结晶的成功率也由背景技术的-30％-67％提高40％-80％。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种提高蛋白质结晶成功率的方法，具体是一种。
技术介绍
开展蛋白质结构与功能研究，首先要获得蛋白质分子的结构信息。在蛋白质结构解析方法中，X射线单晶衍射技术作为最成熟、分辨率最高的解析方法，承担了超过87%的蛋白质结构解析任务。实施该技术，需要高质量的蛋白质晶体作为衍射样品。但由于获取高质量蛋白质晶体普遍存在较大的难度，因此，蛋白质结晶是X射线单晶衍射技术解析蛋白质结构的瓶颈环节之一。文献Thakur等在蛋白质结晶条件筛选中添加9种特定的粉末(气相二氧化硅、交联葡萄糖、沙子、二氧化钛、玻璃丝、羟基磷灰石、纤维素、马毛以及干海藻)以及它们的混合物作为异相形核剂诱导10种蛋白质结晶(Nucleation and growth of lysozyme crystals under external electric field. Colloids and Surfaces A Physicochemical and Engineering Aspects,2002,209 (2-3) :139-145)。实验选用 Crystal Screen HT筛选试剂盒，以0. 5 μ g形核剂1 μ L蛋白质溶液的比例将形核剂与蛋白质溶液混合，结晶液滴为IOOnL蛋白质溶液与IOOnL结晶剂溶液的混合液滴。选用气相二氧化硅、交联葡萄糖、沙子作为形核剂的蛋白质结晶的成功率降低至-30<%，-20%，-2%。 其余几种形核剂提高蛋白质结晶成功率在2% -67%之间。这些方法均是利用异相形核的方法，存在如下的缺点(1)在一定程度上提高了蛋白质晶体的成功率，但是由于异相形核仅是提供了一个形核位点，并没有局部提高蛋白质晶体的浓度，因此提高蛋白质结晶成功率效果不显著。(2)由于异相形核剂与蛋白质晶体粘附在一起，导致晶体晶面缺失，不利于提高蛋白质晶体质量。(3)这些异相形核剂，虽然能诱导部分蛋白质晶体形核，但却会成为另外一些蛋白质形核的抑制剂。
技术实现思路
为了解决现有的蛋白质结晶方法难以同时提高结晶成功率和晶体质量的技术问题，本专利技术提供一种。该方法利用对蛋白质具有吸附一解吸附功能的吸附材料，在结晶溶液中同时形成两个浓度区域，在吸附材料附近的高浓度区，及远离吸附材料的低浓度区。从而同时达到高浓度条件促使蛋白形核，低浓度条件促使蛋白晶体生长。将吸附材料置于溶液内的上方位置，晶体在上方形核，起到提高结晶成功率的作用。而当晶体长大到数微米尺度时，因重力作用，沉降到溶液内下方位置， 该位置溶液浓度低，又可以起到提高晶体质量的作用。此外，由于晶体生长消耗溶质，其周边浓度降低，此时，吸附的蛋白质又会被解吸附，补充到溶液中，使晶体生长过程中，其周边溶液浓度变化更平缓，也有利于高质量晶体的生长。因此，本专利技术既可以提高蛋白质结晶成功率，又可以提高蛋白质结晶质量。本专利技术的技术方案是一种，其特点是包括下述步骤(a)将浓度为10-80mg/mL、体积为2_20 μ L或者1_6颗吸附-解吸附材料添加到蛋白质结晶容器中拟结晶位置；对于密度大于蛋白质溶液的吸附-解吸附材料的添加方法是在结晶孔板中拟结晶位置涂抹真空脂，用小镊子将吸附-解吸附材料粘附在涂有真空酯的结晶孔板中拟结晶位置上；对于密度小于蛋白质溶液的-解吸附吸附材料的添加方法是将吸附-解吸附材料直接添加到结晶孔板中拟结晶位置；或者将吸附-解吸附材料用酒精分散成溶液，用移液器添加至结晶孔板中拟结晶位置；(b)将拟结晶的蛋白质加入到缓冲液中，溶解，制成浓度> Omg/mL，并且蛋白质溶液的初始浓度是6 50mg/mL ；(c)将蛋白质结晶试剂与蛋白质溶液按照体积比为1 0. 1 4混合，配制出蛋白质结晶溶液；(d)将蛋白质结晶溶液添加到蛋白质结晶容器中拟结晶位置，与蛋白质结晶容器中吸附-解吸附材料混合；(e)将蛋白质结晶溶液与蛋白质结晶试剂置于同一密封空间但不互相接触，形成一个稳定的气相扩散体系，在恒温4 22°C温度范围内静置4 30天，实现结晶。所述吸附-解吸附材料是无机纳米材料、聚合物纤维或者聚合物吸附树脂的任一种。所述无机纳米材料包括粘土矿和活性氧化铝。所述聚合物纤维是聚丙烯晴碳纤维。所述聚合物吸附树脂是α -甲基聚苯乙烯微球、磁性聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚苯乙烯/丙烯腈共聚微球、聚苯乙烯/ 二氧化钛有机/无机复合微球或者烷基聚苯乙烯二乙烯基苯微球任一种。优选的聚合物吸附树脂是以苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、乙酸乙酯、氯乙烯、四氟乙烯或者丙烯腈的任一种单体的聚合物吸附树脂。所述缓冲液是PH= 4. 60，0. 25 的M Tris-HCL或者ρΗ为 7. 00，0. 025 的M HEPES-Naο所述蛋白质结晶筛选试剂盒是Crystal Screen HT、Crystal Screen、Crystal Screen 2、Crystal Screen Cryo> Crystal Screen 2Cryo> SaltRx HT、MembFac> Natrix HTStura Footprint、 Clear Strategy Screen I、 Clear Strategy Screen II、 MorpHeus HT.PACT premier HT 或者 MorpHeus HT 的任一种。所述蛋白质结晶容器是蛋白质晶体坐滴板或悬滴板中的任一种。本专利技术的有益效果是由于利用对蛋白质具有吸附-解吸附功能的吸附材料，在结晶溶液中同时形成两个浓度区域，在吸附材料附近的高浓度区，及远离吸附材料的低浓度区。从而同时达到高浓度条件促使蛋白形核，低浓度条件促使蛋白晶体生长。将吸附材料置于溶液内的上方位置，晶体在上方形核，起到提高结晶成功率的作用。而当晶体长大到数微米尺度时，因重力作用，沉降到溶液内下方位置，该位置溶液浓度低，又可以起到提高晶体质量的作用。此外，由于晶体生长消耗溶质，其周边浓度降低，此时，吸附的蛋白质又会被解吸附，补充到溶液中，使晶体生长过程中，其周边溶液浓度变化更平缓，也有利于高质量晶体的生长。因此，既提高了蛋白质结晶成功率，又提高了蛋白质结晶质量。蛋白质结晶成功率由
技术介绍
的-30% -67%提高40% -80%。下面结合具体实施方式对本专利技术作详细说明。具体实施例方式实施例1 溶菌酶结晶条件的筛选。1、制备吸附-解吸附材料的结晶孔板。将孔径为20-50nm的α -甲基聚苯乙烯微球用酒精超声分散，配制成浓度为lOmg/mL的悬浊液。分别向96孔坐滴板(美国Hampton公司，货号为HR3-143， 96-wellsitting-drop Intelli-Plates)的每个结晶小孔的拟结晶位置添加4 μ L，浓度 40mg/mL的α -甲基聚苯乙烯微球。2、制备溶菌酶溶液。将六次重结晶的溶菌酶(日本kikagaku公司，货号为837059)溶于pH = 4. 60， 0. 25M Tris-HCL缓冲液中，然后用0. 22 μ m的滤膜过滤，滤去杂质，制得初始浓度为40mg/ mL的溶菌酶溶液。3、制备蛋白质结晶溶液。用自动移液系统将Hampton公司Crystal Screen HT结晶试剂盒中的蛋白质结晶试剂分别向每个结晶深孔中添加池液90 μ L本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种同时提高蛋白质结晶成功率及晶体质量的方法，其特征在于包括下述步骤：（ａ）将浓度为１０－８０ｍｇ／ｍＬ、体积为２－２０μＬ或者１－６颗吸附－解吸附材料添加到蛋白质结晶容器中拟结晶位置；对于密度大于蛋白质溶液的吸附－解吸附材料的添加方法是在结晶孔板中拟结晶位置涂抹真空脂，用小镊子将吸附－解吸附材料粘附在涂有真空酯的结晶孔板中拟结晶位置上；对于密度小于蛋白质溶液的－解吸附吸附材料的添加方法是将吸附－解吸附材料直接添加到结晶孔板中拟结晶位置；或者将吸附－解吸附材料用酒精分散成溶液，用移液器添加至结晶孔板中拟结晶位置；（ｂ）将拟结晶的蛋白质加入到缓冲液中，溶解，制成浓度＞０ｍｇ／ｍＬ，并且蛋白质溶液的初始浓度是６－５０ｍｇ／ｍＬ；（ｃ）将蛋白质结晶试剂与蛋白质溶液按照体积比为１∶０．１－４混合，配制出蛋白质结晶溶液；（ｄ）将蛋白质结晶溶液添加到蛋白质结晶容器中拟结晶位置，与蛋白质结晶容器中吸附－解吸附材料混合；（ｅ）将蛋白质结晶溶液与蛋白质结晶试剂置于同一密封空间但不互相接触，形成一个稳定的气相扩散体系，在恒温４－２２℃温度范围内静置４－３０天，实现结晶。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：尹大川，郭云珠，曹慧玲，张辰艳，马晓亮，崔超，
申请(专利权)人：西北工业大学，
类型：发明
国别省市：87