本发明专利技术提供碳纳米管-壳聚糖-藻蓝蛋白复合物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述碳纳米管-壳聚糖-藻蓝蛋白复合物是由多壁碳纳米管、水溶性壳聚糖和螺旋藻藻蓝蛋白非共价结合形成，该复合物对乳腺癌MCF-7细胞和肝癌HepG2细胞具有良好的生长抑制作用，特别在近红外光和可见光的照射下，对肿瘤细胞的抑制作用进一步加强，都呈现出杀灭肿瘤细胞的特征。本发明专利技术提供的碳纳米管-壳聚糖-藻蓝蛋白复合物作为抗肿瘤生物医学材料，在肿瘤细胞光动力治疗和光热治疗中具有广阔的前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及藻蓝蛋白复合物的应用，具体涉及碳纳米管-壳聚糖-藻蓝蛋白复合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
技术介绍
在蓝藻细胞中，藻蓝蛋白(Phycocyanin，PC)是一类普遍存在的光合辅助色素，是一种特殊的色素蛋白。研究表明，藻蓝蛋白具有显著的抗肿瘤活性，具有提高淋巴细胞活性，增强机体的防病、抗病能力。藻蓝蛋白在波长^0nm、360nm和620nm处有特征吸收峰。 可在体外对人癌细胞产生光动力体外杀伤效应。碳纳米管(carbon nanotube, CNT)具有独特的巢式圆柱石墨烯结构，直径从几纳米到几百纳米之间变化，长度亦可从几纳米到几微米之间变化。碳纳米管经近红外光谱辐射后，能释放大量的振动能。因为所释放的这些能量可以使组织产生局部热量，从而使碳纳米管具有可能应用于癌症治疗的潜力。因机体组织缺乏吸收近红外光谱的发色团，所以近红外光可以穿透机体组织，并对其产生微小的影响。与单壁碳纳米管(singlewalled carbon nanotube, SffNT)相比，多壁碳纳米管(multi-wall carbon nanotube，MWCNT)能吸收更多的近红外光，因为MWNT单位吸收微粒具有更多有效电子，而且单位质量的碳纳米管拥有更多的金属导管。但是碳纳米管容易团聚成束，水分散性和生物相容性较差.壳聚糖 (chitosan,CS)是由自然界广泛存在的几丁质(chitin)经过脱乙酰作用得到的，化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖.壳聚糖能被生物体内的溶菌酶降解生成天然的代谢物，具有无毒、能被生物体完全吸收的特点，因此用它作药物载体具有较大的优越性。 水溶性壳聚糖是从壳聚糖经羧化改性而制成，易溶于水，性质稳定，用具有良好生物相容性的壳聚糖修饰碳纳米管，可改进碳纳米管水分散性和生物相容性.光动力治疗(Photodynamic Therapy，PDT)是治疗肿瘤的一种新技术。其过程是，首先肿瘤组织选择性摄取光敏剂，并储于其内，随后在适当波长光线局部照射后，光敏剂被激活，而激发态的光敏剂又把能量传递给周围的氧，生成活性很强的单态氧，单态氧和相邻的生物大分子发生氧化反应，产生细胞毒性作用，进而导致细胞受损乃至死亡。光热治疗 (Photothermal Therapy，PTT)是使用具有穿透性好的激光(通常使用红外光)选择性地照射肿瘤组织，使组织产生光热，温度升高，导致细胞死亡。因此，新型高效的既有光动力治疗又有光热治疗前景的生物医学材料在肿瘤治疗中具有重要意义。
技术实现思路
为克服上述相关技术的缺陷和不足，同时拓展藻蓝蛋白的应用，本专利技术提供碳纳米管-壳聚糖-藻蓝蛋白复合物在制备抗肿瘤药物中的应用。本专利技术所述的碳纳米管-壳聚糖-藻蓝蛋白复合物(MWCNT-CS-PC)是由羧化碳纳米管、通过水溶性壳聚糖非共价修饰碳纳米管，制备得到水溶性的多壁碳纳米管-壳聚糖 (MWCNT-CS)纳米粒，并在此基础上将复合物再与高纯度的螺旋藻藻蓝蛋白偶合而得到，其具体制备工艺如下(1)将羧基化多壁碳纳米管分散在磷酸缓冲液中，经超声振荡30分钟 90分钟后，再加入水溶性壳聚糖，超声振荡并充分搅拌均勻，得混合溶液；然后静置分层，将分层后的上层液离心分离，得到的上层液即为壳聚糖修饰的水溶性多壁碳纳米管溶液；所述羧基化多壁碳纳米管和水溶性壳聚糖的质量比为1:1 1:10 ；(2)向步骤(1)得到的水溶性多壁碳纳米管溶液中加入相当于羧基化多壁碳纳米管质量1 5倍的碳二亚胺盐酸盐和相当于羧基化多壁碳纳米管质量1 6倍的N-羟基琥珀酰亚胺，在避光条件下加入藻蓝蛋白粉末，于10°C 25°C恒温振荡8小时 15小时；将振荡后溶液过滤，所得滤饼即为碳纳米管-壳聚糖-藻蓝蛋白复合物；所述藻蓝蛋白粉末与羧基化多壁碳纳米管的质量比为1:1 1:10。步骤(1)所述的羧基化多壁碳纳米管纯度为90% 99%，直径为10 nm 20nm，长度为0·5μπι 2μ m，羧化率lwt% 10 wt% (重量百分率)。上述水溶性壳聚糖的羧化度为0. 1% 1%，分子量为500 10000。上述藻蓝蛋白纯度为4. 0 6. 0 (A620/A280,在波长620nm与^Onm的吸光度之比)。上述磷酸缓冲液为磷酸钠缓冲液或2mM 5mM (毫摩尔)磷酸钾缓冲液。步骤(2)得到的振荡后混合液采用分子量为IOkD IOOkD (千道尔顿)的超滤管超滤。通过上述工艺制备稳定的碳纳米管-壳聚糖-藻蓝蛋白复合物既具有藻蓝蛋白的光动力治疗潜力，又具有碳纳米管的光热治疗潜力，并且通过引入水溶性壳聚糖进行修饰， 增加了该复合物的生物相容性。本专利技术通过体外研究实验，提供了碳纳米管-壳聚糖-藻蓝蛋白复合物在制备抗肿瘤药物中的应用。细胞抑制率和细胞存活率的计算公式如下细胞抑制率(%) = (1-试验组0D490值/对照组0D570值)X 100% (1) 试验组0D490细胞存活率(%)=--X 100%(2)对照组0D490本专利技术的体外研究包括肿瘤细胞生长抑制和激光辐照下肿瘤细胞生长抑制两部分。肿瘤细胞生长抑制是将肿瘤细胞在含胎牛血清的DMEM完全培养液中进行传代培养，然后再接种于96孔培养板培养以除去原来的培养基，然后再加入不含小牛血清的高糖DMEM完全培养基，然后加入碳纳米管-壳聚糖-藻蓝蛋白复合物，调节加入的复合物的浓度，以不加入该复合物的培养组作为阴性对照组，按照上述两公式计算细胞抑制率和细胞存活率。激光辐照下肿瘤细胞生长抑制是将肿瘤细胞在含胎牛血清的DMEM完全培养液中进行传代培养，然后再接种于96孔培养板培养以除去原来的培养基，再加入新鲜的不含小牛血清的高糖DMEM完全培养基，然后加入上述的复合物，以不加所述复合物的培养基液孔作为阴性对照组，分别培养一定时间后，培养基液用PBS洗涤，向剩余的培养基液中加入新鲜低糖DMEM完全培养基，采用808nm或532nm激光辐照培养孔，撤除辐照源之后继续培养一定时间。同样按照上述公式进行细胞抑制率和存活率的计算。体外研究结果表明，该复合物对体外培养的乳腺癌MCF-7细胞和肝癌HepG2细胞具有良好的生长抑制作用，特别在近红外光和可见光的照射下，抑制作用进一步加强，都呈现出杀灭肿瘤细胞的特征，本专利技术提供的碳纳米管-壳聚糖-藻蓝蛋白复合物可作为制备抗肿瘤的药物。本专利技术的优点在于(1)水溶性壳聚糖和藻蓝蛋白修饰碳纳米管将提高复合物的水溶解性和生物相容性；(2)碳纳米管-壳聚糖-藻蓝蛋白复合物在近红外光和可见光的照射下，都有杀灭肿瘤细胞的特征。附图说明图1为多壁碳纳米管MWCNT以及实施例1所制备的中间样品MWCNT-CS和产品 mwcnt-cs-pc的红外谱图。具体实施例方式下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步的详细描述，但具体实施方式不应理解为是对本专利技术保护范围的限定。各实施例所采用的乳腺癌MCF-7细胞和肝癌HepG2细胞来源于中山大学医学院实验中心。实施例1碳纳米管-壳聚糖-藻蓝蛋白复合物(MWCNT-CS-PC)的制备(1)称取40mg直径为IOnm的羧基化碳纳米管粉末(羧化率为lwt%)，加入150ml5mM PBS溶液中，超声分散60分钟，然后加入170mg水溶性壳聚糖CS，继续超声振荡60分钟， 超声本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．碳纳米管－壳聚糖－藻蓝蛋白复合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张学武，廖晓霞，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：81
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