本发明专利技术涉及一种具有肿瘤靶向性的基因载体材料及其制备方法和应用。它是以功能化氧化石墨烯作为siRNA等基因分子的靶向输送载体，首先将肿瘤细胞靶向分子叶酸与氨基封端的聚乙二醇通过酰胺键连接；再将氧化石墨烯与上述偶联物通过酰胺键连接，得到具有肿瘤靶向性的功能化氧化石墨烯；然后将氨基化的具有芳香共轭结构的分子通过π-π共轭锚定到氧化石墨烯表面；最后利用带正电性的功能化氧化石墨烯与具有带负电性的基因分子通过静电作用相互吸附在一起，制备出具有肿瘤靶向性的高效基因输送体系。该载体材料对叶酸受体表达较高的肿瘤细胞具有较好的靶向性，负载siRNA后能降低相应的靶基因水平及相关蛋白表达。本发明专利技术为基因的体内靶向输送提供了新方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种靶向性基因载体材料及制备和应用，具体说是基于功能化氧化石墨烯的新型具有肿瘤靶向性的小干扰RNA载体材料及其制备方法和应用。
技术介绍
RNA干扰治疗是目前最具潜力与最有效的遗传治疗方法。它是由双链RNA特异性地抑制其互补基因表达的一种基因沉默机制，是多种生物体内由双链RNA介导的同源mRNA 降解现象。小分子干扰核糖核酸(small interfering dsRNA, siRNA)分子阻断基因表达的机制，是因为它以与序列同源互补的mRNA为标靶，降解特定的mRNA，从而导致基因沉默效应。然而siRNA本身不稳定、易降解和不易穿入细胞，所以阻碍了 siRNA到靶细胞的输送。 如何siRNA有效的载送到靶细胞，发挥作用，是目前研究的焦点。因而急切需要一个能使 siRNA保持稳定，能够有效进入细胞，并且能够体内应用的siRNA载体转染方法。良好的载体应具备对正常细胞和组织无损害、高负载量、高稳定性、靶向性、高的靶组织滞留性、对组织和细胞膜的高渗透性等特点。目前常用的siRNA载体主要有三种脂质体、质粒和病毒。 由于质粒和病毒siRNA载体具有潜在的安全问题，脂质体类载体具有不稳定性和缺乏缓释性，这就严格限制了它们作为siRNA载体的应用。石墨烯是2004年被发现的一种新型碳纳米材料，它是由SP2杂化碳原子构成的具有单原子层结构的理想平面二维新型碳纳米材料，它的单原子厚度和二维的平面结构提供了它极大的比表面积，使其可用来负载大量的各种分子，包括各种金属、生物分子、荧光分子和多种药物等，从而使其在药物及基因的靶向输送以及生物分子的检测、分离和纯化等方面具有许多潜在的应用。单层石墨经氧化后所得到的氧化石墨烯表面带有大量亲水基团，如羧基、羟基、环氧基、羰基等，使其成为具有很好水溶液分散性的双亲性载体材料。研究证明功能化的氧化石墨烯具有很好的生物相容性，能高效进入细胞，并不显示生物毒性。 氧化石墨烯的大比表面积、高稳定性、能携带大量分子、更重要的是缺乏抗原性、可进行靶向性修饰和它们潜在的缓释性，显示了它作为siRNA载体的可能性。此前，已经有研究者密切关注氧化石墨烯在药物靶向输送和细胞呈像方面的研究及应用，而其作为基因载体的研究还很少。然而要实现用氧化石墨烯携带siRNA进入肿瘤细胞，首先需要氧化石墨烯先载着 siRNA到达肿瘤细胞。一种常见的实现基因或药物靶向输送的方法是在转运载体上连接能够与肿瘤细胞表面的某些特定分子相互作用的特异性配体，例如作用于肿瘤细胞表面抗原的单克隆抗体、作用于细胞表面叶酸受体的叶酸或作用于细胞表面铁传递蛋白受体的铁传递蛋白等都可以增强载体材料的肿瘤细胞靶向传输效果。其中叶酸是一种常用且效果较好的肿瘤细胞靶向分子，与它特异性相互作用的叶酸受体在大部分恶性肿瘤中具有高度表达，有时可比正常组织高出100 300倍。细胞膜共振提示叶酸纳米粒子在肿瘤细胞中的浓度比游离叶酸高10倍，叶酸对于卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、头颈部肿瘤及粒细胞白血病等多种肿瘤细胞都有很好的靶向效果。因此本研究采用叶酸修饰的氧化石墨烯作为肿瘤细4胞靶向输送载体，在载体的导向下把SiRNA运送到靶组织，使其有选择的集中于人体的特殊部位，从而降低靶基因表达，以减少其在非靶向组织的无效流失，从而提高其传递效率， 此项研究可以作为以SiRNA为基础的靶向体内治疗的新方法，也为其它药物的体内携带提供了一个新思路。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于氧化石墨烯的靶向性基因载体材料及制备和应用， 它是针对现有的siRNA载体毒性高，转染效率低且不稳定，不具备临床应用价值等方面的不足，采用功能化氧化石墨烯作为siRNA等基因分子的靶向输送载体，提供一种低毒高效的siRNA转染剂，将其传递入肿瘤细胞，从而达到抑制靶基因和相关蛋白表达的目的。本专利技术是将肿瘤细胞靶向分子叶酸与氨基封端的聚乙二醇通过酰胺键连接，制备二者偶联物，然后再利用氧化石墨烯上的羧基与上述偶联物另一端的氨基通过酰胺键连接，得到具有很好生物相容性的的肿瘤靶向性的氧化石墨烯。然后将氨基化的具有芳香共轭体系的分子通过n-n共轭锚定到氧化石墨烯表面，最后利用带正电性的功能化氧化石墨烯与带负电性的siRNA通过静电作用相互吸附在一起，制备出具有很好生物相容性的肿瘤靶向性高效基因输送体系。本专利技术提供的一种基于功能化氧化石墨烯的肿瘤靶向性基因载体材料是以叶酸和聚乙二醇偶联物修饰的功能化氧化石墨烯接枝氨基化的具有芳香共轭体系的分子盐酸氨甲基化芘、盐酸氨基化卟啉或盐酸阿霉素后作为载体，负载基因分子siRNA或DNA 制成，其中，叶酸、聚乙二醇、氧化石墨烯与氨基化的具有芳香共轭体系的分子的质量比 1 2-100 2-20 0.01-100。制备方法是将叶酸和氨基封端的聚乙二醇混溶于N，N- 二甲基亚砜和水的混合溶剂搅拌反应，旋蒸，浓缩物过葡聚糖凝胶柱，产物叶酸和聚乙二醇偶联物浓缩冻干后在脱水剂的存在下与氧化石墨烯超声搅拌反应，分离，洗涤产物，再与盐酸氨基化的具有芳香共轭体系的分子超声搅拌反应，最后加入盐酸调节PH值为1 3，反应结束后固体产品经反复离心洗涤，得到带正电荷的功能化氧化石墨烯，分散在水或培养基RPMI1640中与基因分子混合，孵育即可。所述的基因分子的负载量为0. 5 50wt%。所述的siRNA是指具有RNA干扰作用的各种RNA，优选的有抑制肿瘤生长的端粒酶反转录酶siRNA、抑制肿瘤细胞多药耐药性的多药耐药siRNA、抑制肿瘤细胞生长或诱导肿瘤细胞凋亡的siRNA和具有免疫调节作用的各种siRNA等中的一种或两种等。所述的DNA是指碱基数小于1万的任意单股或双股DNA序列。所述的氧化石墨烯是指分子骨架由六边形晶格排列的单层石墨原子组成，且经过功能化而得到的含有含氧基团(羧基、羟基、环氧基和羰基)的二维平面材料，其厚度分布在0. 3nm到2nm之间，大小分布在IOnm2到400 μ m2之间。该功能化氧化石墨烯材料可采用机械剥离法、晶体外延生长法及化学氧化等方法制备。该氧化石墨烯材料能很好的分散到水溶液中。本专利技术提供的一种基于功能化氧化石墨烯的肿瘤靶向性基因载体材料的制备方法包括如下的步骤1)聚乙二醇和叶酸偶联物的制备在脱水剂的存在下，将叶酸和氨基封端的聚乙二醇混溶于N，N-二甲基亚砜和水的混合溶剂中(体积比为4 1)，室温搅拌一天，体系旋蒸脱溶，浓缩物过葡聚糖凝胶柱以除去小分子杂质，将产物浓缩冻干，获得二者偶联产物。2)将步骤1)制备的偶联产物修饰在氧化石墨烯上，在脱水剂的存在下，将叶酸和聚乙二醇偶联物与氧化石墨烯混合超声溶于水中(水浴超声60W，1小时)，室温搅拌四天， 产物通过反复离心、超声分散(水浴超声60W，2分钟)循环，进行洗涤，除去未反应的偶联物。3)利用π-π共轭将盐酸氨基化的具有芳香共轭结构的分子(可为盐酸氨甲基化芘、盐酸氨基化卟啉或盐酸阿霉素等)负载到步骤幻的产物上，二者超声共混(水浴超声 60W, 1小时)，室温搅拌反应M小时，然后加入盐酸调节ρΗ值为1 3，使功能化的氧化石墨烯带正电荷，反应结束后固体产品经反复离心洗涤，得到带正电荷的功能化氧化石墨烯。4)将上述步骤幻制得的功能化氧化石墨烯分散在水或培养基中与SiRNA混本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种基于功能化氧化石墨烯的肿瘤靶向性基因载体材料，其特征在于它是以叶酸和聚乙二醇偶联物修饰的功能化氧化石墨烯接枝氨基化的具有芳香共轭体系的分子盐酸氨甲基化芘、盐酸氨基化卟啉或盐酸阿霉素后作为载体，负载基因分子ｓｉＲＮＡ或ＤＮＡ制成，其中，叶酸、聚乙二醇、氧化石墨烯与氨基化的具有芳香共轭体系的分子的质量比：１∶２－１００∶２－２０∶０．０１－１００；制备方法是：将叶酸和氨基封端的聚乙二醇混溶于Ｎ，Ｎ－二甲基亚砜和水的混合溶剂搅拌反应，旋蒸，浓缩物过葡聚糖凝胶柱，产物叶酸和聚乙二醇偶联物浓缩冻干后在脱水剂的存在下与氧化石墨烯超声搅拌反应，分离，洗涤产物，再与氨基化的具有芳香共轭体系的分子搅拌反应，最后调节ｐＨ值为１～３，分离，洗涤产物，得到带正电荷的功能化氧化石墨烯，分散在水或培养基ＲＰＭＩ１６４０中与基因分子混合，孵育即可；所述的基因分子的负载量为０．５～５０ｗｔ％。
【技术特征摘要】
1.一种基于功能化氧化石墨烯的肿瘤靶向性基因载体材料，其特征在于它是以叶酸和聚乙二醇偶联物修饰的功能化氧化石墨烯接枝氨基化的具有芳香共轭体系的分子盐酸氨甲基化芘、盐酸氨基化卟啉或盐酸阿霉素后作为载体，负载基因分子siRNA或DNA 制成，其中，叶酸、聚乙二醇、氧化石墨烯与氨基化的具有芳香共轭体系的分子的质量比 1 2-100 2-20 0.01-100 ；制备方法是将叶酸和氨基封端的聚乙二醇混溶于N，N-二甲基亚砜和水的混合溶剂搅拌反应，旋蒸，浓缩物过葡聚糖凝胶柱，产物叶酸和聚乙二醇偶联物浓缩冻干后在脱水剂的存在下与氧化石墨烯超声搅拌反应，分离，洗涤产物，再与氨基化的具有芳香共轭体系的分子搅拌反应，最后调节PH值为1 3，分离，洗涤产物，得到带正电荷的功能化氧化石墨烯，分散在水或培养基RPMI1640中与基因分子混合，孵育即可；所述的基因分子的负载量为0. 5 50wt%。2.根据权利要求1所述的基因载体材料，其特征在于所述的siRNA是指具有RNA干扰作用的各种RNA，优选的有抑制肿瘤生长的端粒酶反转录酶siRNA、抑制肿瘤细胞多药耐药性的多药耐药siRNA、抑制肿瘤细胞生长或诱导肿瘤细胞凋亡的siRNA和具有免疫调节作用的各种siRNA等中的一种或两种。3.根据权利要求1所述的基因载体材料，其特征在于所述的DNA是指碱基数小于1万的任意单股或双股DNA序列。4.根据权利要求1所述的基因载体材料，其特征在于所述的氧化石墨烯是指分子骨架由六边形晶格排列的单层石墨原子组成，且经过功能化而得到的含有含氧基团(羧基、羟基、环氧基和羰基)的二维平面材料，其厚度分布在0. 3nm到2nm之间，大小分布在IOnm2到 400 μ m2 之间。5.一种基于功能化氧化石墨烯的肿瘤靶向性基因载体材料的制备方法包括如下的步骤1)聚乙二醇和叶酸偶联物的制备在脱水剂的存在下，将叶酸和氨基封端的聚乙二醇混溶于N，N-二甲基亚砜和水的混合溶剂中(体积比为4 1)，室温搅拌一天，体系旋蒸脱溶，浓缩物过葡聚糖凝胶柱以除去小分子杂质，将产物浓缩冻干，获得二者偶联产物；2)将步骤1)制备的偶联产物修饰在氧化石墨烯上...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨晓英，段宏泉，王银松，陈永胜，马延风，黄毅，
申请(专利权)人：天津医科大学，
类型：发明
国别省市：12
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