菘蓝根外植体器官发生方法技术

一种菘蓝根外植体器官发生方法，包括毛状根的形成、分化不定芽、生根，具体选取在MS固体培养基上继代培养的菘蓝试管苗根或10～15天的无菌种子苗幼根，切成长度为0.5～1.0cm的根段，作为培养外植体；外植体接种于液体分化培养基上进行培养，诱导形成毛状根。本发明专利技术所提供的菘蓝植株再生方法，具有取材方便，不受季节限制，诱导增殖系数高，毛状根在分化培养基中仅需2-7天就可逐步分化出不定芽，具有培养时间短的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及利用植物组织培养技术培养菘蓝试管苗无菌根获得再生植株的方法， 属于植物生物

技术介绍
( Isatis indigotica Fort. )禾斗(cruciferaeIsatis Linn) 2年生草本植物。菘蓝全株入药，是我国南北各地广为栽培的药用植物。在中药学中，菘蓝的干燥根称为板蓝根，干燥叶称为大青叶，两者都具有清热解毒、凉血消斑的功效， 广泛用于各种方剂中。大青叶中所含生物碱类化学成分靛玉红还有治疗慢性粒细胞白细胞病的作用。利用组织培养进行快速繁殖和高产栽培、对节约耕地、提高产量有重要意义。在植物离体器官发生过程中，根据不同的培养条件，不定芽可以不经过愈伤组织阶段从外植体上直接分化形成(直接器官发生)；也可以从外植体脱分化形成的愈伤组织中发生(间接器官发生)。有关菘蓝组织培养直接器官发生和间接器官发生生成不定芽均有报道。叶片在 MS + 6 - BA 2 mg/L+ NAA 1 mg/L培养可直接诱导形成不定芽(中草药，1995，( 1) :52)； 用含KT 2 mg/L + NAA 0.2 mg/L的MS培养基诱导菘蓝下胚轴分化形成不定芽，诱导率达 87. 5% (西南师范大学学报，2004，四(6):1069);用菘蓝嫩叶、叶柄和嫩茎为外植体(四川师范学院学报，1991,12 (4) 358)，以下胚轴为外植体分别建立了菘蓝的快速繁殖体系(中国中药杂志，1993，18(1):21)，这些都是直接器官发生的报道。而附加6-BA 0.5 mg/L和NAA 0.2 mg/L的MS培养基诱导欧洲菘蓝子叶愈伤组织(湖北大学学报(自然科学版)，2006，观 (2) :183)，以及“不同培养基对菘蓝叶片组织培养的效应，广西热带农业，2007，(6) :30”等报道是菘蓝通过间接器官发生途径再生。组织培养过程中，采用不同来源外植体和不同培养条件对优化培养过程，降低生产成本具有积极意义。根段相对于其他类型外植体具有以下优点首先，它们很容易获得， 其次，根作为外植体不会彻底杀死供体植株，另外，根中还可获得稳定的次生代谢产物。液体培养作为试管苗培养的方式也有着独特的优点，液体培养基省略了琼脂等凝固剂，降低了经济成本，减少了凝固剂的杂质，保证了培养基在分批配制中的一致性，并且液体培养基更易于配制。已有的菘蓝组培文献报道中，无论是直接器官发生、还是间接器官发生，都是以菘蓝子叶、叶片、下胚轴或子房为外植体，在固体培养基上通过不同激素的配比，诱导外植体的分化，完成其再生过程。
技术实现思路
本专利技术的目的是以菘蓝试管苗或无菌苗的根为外植体，培养形成大量的毛状根， 毛状根进一步培养可逐步分化出不定芽，进而生根、长成完整植株。本专利技术具有取材方便， 不受季节限制，诱导增殖系数高，培养时间短的优点。本专利技术的实现过程如下一种，包括毛状根的形成、分化不定芽、生根，其特征在于 以菘蓝试管苗或无菌苗的根为外植体，培养形成大量的毛状根。毛状根的培养选取在MS固体培养基上继代培养的菘蓝试管苗根或10-15天的无菌种子苗幼根，切成长度为0. 5 1. Ocm的根段，作为培养外植体；外植体接种于液体分化培养基上进行培养，诱导形成毛状根。所述的MS固体培养基组成为MS基本培养基，附加30 g/L蔗糖，7 g/L琼脂，pH 为 5. 8 6. 2 ；液体分化培养基组成为MS基本培养基，附加0 2 mg/L 6-BA，0 lmg/ L NAA, 30 g/L蔗糖，调pH到5.8 6. 2。上述形成的毛状根在固体或液体分化培养基上分化形成不定芽，液体分化培养基组成为MS基本培养基，附加0 2 mg/L 6-BA，0 lmg/ L NAA, 30 g/L蔗糖，调pH到 5. 8 6. 2 ；固体分化培养基是在液体分化培养基中加入7 g/L琼脂。上述形成的不定芽切成单株，接种至生根培养基中生根，生根培养基组成为MS 基本培养基，附加0 1 mg/L IBA, 0. 5 lmg/L NAA, 30 g/L蔗糖，7 g/L琼脂，调pH到 5. 8 6. 2。继代苗或无菌苗的培养、毛状根培养、分化不定芽、生根培养温度为25 士 2 光照强度是30 40 mol · πΓ2 · s—1，16 h / 8 h光/暗培养，液体振荡培养转速80 r/min。本专利技术的优点和积极效果现有组培技术方法中，毛状根的获得通常都是通过发根农杆菌转化的方法，专利技术人发现菘蓝根在液体培养基中未经转化先形成大量的毛状根，本专利技术可获得一种新的可用于药理学和植物化学研究的根扩增体系。对于用根的药用植物而言，根中的次生代谢产物含量高于其他组织，在体外建立根培养体系利于药用成分的提取利用。本专利技术所提供的菘蓝植株再生方法，具有取材方便，不受季节限制，诱导增殖系数高，毛状根在分化培养基中仅需 2-7天就可逐步分化出不定芽，具有培养时间短的优点，对于菘蓝的育种及加速良种的无性繁殖具有积极作用。附图说明图1为液体分化培养的毛状根； 图2为液体分化培养的不定芽；图3为再生完整植株； 图4为固体分化培养的毛状根。具体实施例方式本专利技术使用的缩略语对应的中文名称如下6-BA (6-苄基嘌呤)NAA (萘乙酸)IBA (3-吲哚丁酸)本专利技术使用的MS培养基按手册通用方法配制，组成与含量如下大量元素NH4NO3 1650 mg/L, KNO3 1900 mg/L，CaCl2 · 2H20 440 mg/L，MgSO4 · 7H20 370mg/L, KH2PO4 1700 mg/ L ；微量元素KI 0. 83 mg/L, H3BO3 6.2 mg/L，MnSO4 · 4H20 22. 3 mg/L，ZnSO4 · 7H20 8.6 mg/L，Na2MnO4 ·2Η20 0. 25 mg/L，CuSO4 · 5Η20 0. 025 mg/L，CoCl2 ·6Η20 0. 025 mg/L，FeSO4 · 7H20 (27. 8)mg/L +Na2-EDTA · 2H20 (27. 3) mg/L ；有机成分肌醇 100 mg/L，烟酸 0.5 mg/L，盐酸吡哆醇(维生素B6) 0.5 mg/L，盐酸硫胺素(维生素Bi) 0.5 mg/L，甘氨酸2 mg/L。以下通过实施例进一步描述本专利技术。实施例1 菘蓝种子剥除果皮，70 %的乙醇浸洗60 s，而后0.1 % HgCl2消毒10 min,无菌水振荡清洗5次，置于无菌滤纸上吸干水分，接种于MS培养基上于黑暗处萌发，获得无菌苗。培养10 15d的无菌苗根、下胚轴切成约1 cm的小段，子叶切成约0. 5X0. 5 cm 的小块，置于附加ang/L的6-BA和O.aiig/L NAA, 3%蔗糖，0.7%琼脂的固体分化培养基上进行分化培养。均可出现绿色芽点，继续培养每个芽点处可形成不定芽，呈丛生状。将生长状态良好的丛生不定芽苗切成单株，接种在附加0.4 mg/L IBA的MS生根培养基诱导不定芽的生根，生根率达85. 4%。再生的组培苗可通过扦插方式继代培养。通过上述组织培养过程获得的继代无菌苗根切成约1 cm的小段，置于不附加激素的液体分化培养基上振荡培养。根段首先形成大量的白色毛绒状根，包裹整个外植体(图 1)。将白色毛绒状根接本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种菘蓝根外植体器官发生方法，包括毛状根的形成、分化不定芽、生根，其特征在于：以菘蓝试管苗或无菌苗的根为外植体，培养形成毛状根。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：步怀宇，潘红艳，李娜，毕彦博，王英娟，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：87