一种脱色多种活性染料的细菌的筛选方法技术

本发明专利技术涉及一种脱色多种活性染料的细菌的筛选方法，包括：(1)将活性染料污泥用无菌玻璃珠打散后制成的菌悬液接种于富集培养基中，使用含有不同浓度梯度的染料在富集培养基中驯化4周；(2)将驯化后的菌液，取OD值为1的菌液，做梯度稀释，每个稀释度的菌液均匀涂布到固体培养基上于35℃厌氧培养48h，重复此步骤直至固体培养基上长出的菌落大小均匀，边缘清晰；将分离到的单菌落划线至含染料的固体培养基上，观察菌落生长情况，将其接种于含染料的液体培养基中，观察菌株脱色效果，将脱色效果好的菌株进行保藏，即得。本发明专利技术分离纯化方法简便快捷，成本低，对环境友好，应用前景广阔。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细菌筛选领域，特别涉及。
技术介绍
随着染料工业的快速发展，印染工业废水和染料生产废水的排放造成了严重的环境问题。染料根据其应用分为酸性染料、分散染料、活性染料等等。活性染料已经成为棉纤维染色用最主要的染料类别，远大于其他染料。偶氮染料因其生产方法简单，具有很广的色谱范围，并具有一定的牢度，因而成为商业应用最多的合成染料。自然界存在的天然偶氮染料很少，工业用偶氮染料几乎全部为人工合成产品，其结构复杂品种繁多，稳定性高，具有很强的抗光、抗氧化的能力，故含偶氮染料的废水通常比较难处理。而且偶氮染料和其代谢物会对人体健康造成危害，具有致癌、致畸、致突变的作用。关于活性染料脱色细菌的研究已有很多，但具有广谱性脱色效果的细菌相对较少。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供，该方法方法简便快捷，成本低，对环境友好，应用前景广阔。本专利技术的，包括(1)将活性染料污泥用无菌玻璃珠打散后制成的菌悬液接种于富集培养基中，使用含有不同浓度梯度的染料在富集培养基中驯化4周；(2)将驯化后的菌液，取OD值为1的菌液，做梯度稀释，每个稀释度的菌液均勻涂布到固体培养基上于35°C厌氧培养48h，重复此步骤直至固体培养基上长出的菌落大小均勻，边缘清晰；将分离到的单菌落划线至含染料的固体培养基上，观察菌落生长情况，将其接种于含染料的液体培养基中，观察菌株脱色效果，将脱色效果好的菌株进行保藏，即得。所述步骤⑴中的富集培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，配方如下牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，蒸馏水1000mL。所述步骤(1)中的含有不同浓度梯度的染料为经滤菌的活性黑5、活性红239、活性蓝19或活性艳橙x-an，浓度梯度分别为50mg/L、100mg/L、150mg/L和200mg/L，改变浓度的时间间隔为7d。所述步骤(1)中的驯化条件为于35°C厌氧驯化。所述步骤⑵中的梯度稀释为KT1 10_7的梯度稀释。所述步骤O)中的固体培养基为步骤(1)中的牛肉膏蛋白胨培养基中加入17g/L 的琼脂粉。所述步骤(2)中的含染料的固体培养基配方为牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠 5g/L,琼脂 20g/L，蒸馏水 IOOOmL,染料 50mg/L。所述步骤( 中的含染料的液体培养基配方为牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L,蒸馏水 IOOOmL,染料 50mg/L。所述保藏为做斜面低温保藏和甘油冷冻保藏，斜面低温保藏所用培养基为将固体培养基高温高压灭菌后，倒入5mL液体于干净试管中，将试管平放在坡面上，使管内培养基形成斜面，且培养基上沿不超过试管的2/3 ；甘油冷冻保藏所用甘油为纯甘油与无菌水体积比为1 1的混合液，将其加入含等体积过夜生长菌液的无菌EP管中，-20°C保藏，以上操作应在无菌操作台上进行。有益效果本专利技术分离纯化方法简便快捷，成本低，对环境友好，应用前景广阔；筛选得到的细菌可应用于脱色活性染料，可耐受强碱性染料废水48h内脱色率可达80%以上。附图说明图1为模式染料活性黑5的分子结构式。 具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1(1)将活性污泥制成的菌悬液接种于富集培养基中，使用含有不同梯度浓度染料的富集培养基驯化4周；其中富集培养基为牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、蒸馏水1000mL，pH = 7. 0-8. 0 ；同时加入梯度浓度的滤菌染料，使培养基中染料的浓度均依次升高，为活性黑50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L，每7d提高一个浓度梯度，于30 35°C， 厌氧条件下进行驯化培养4周；(2)取驯化4周后的样品，静置30分钟，取上层水样lmL，作10—1 10_7梯度稀释。每种稀释浓度分别取ImL菌液于培养皿内，适用无菌刮铲将其均勻涂布在固体培养基表面，将培养皿倒置于35°C厌氧培养箱中培养48h，挑取形态均勻、边缘清晰的单一菌落， 编号，在固体培养基上划线，将培养皿倒置于35°C厌氧培养箱中培养48h，再观察结果，反复几次，并在光学显微镜下使用油镜镜头观察，选取多个视野范围观测，确保95%以上的菌株是纯的单一菌株后，将分离出的菌种接种到斜面培养基上，4°C下保存于冰箱中待后续进行脱色试验。另取600 μ 1液体培养的细菌，加入600 μ 150%甘油，装入灭过菌的EP管中混合均勻，做好标记后保存于-20度。其中固体培养基为富集培养基中加入17g/L的琼脂粉，高温高压灭菌后而冷却形成的培养基，斜面培养基为将固体培养基高温高压灭菌后，趁热倒入5mL液体于干净试管中，将试管平放在坡面上，使管内培养基形成斜面，且培养基上沿不超过试管的2/3，以上操作在无菌操作台上进行。(3)分别挑取经分离纯化后的单一菌落于含50mg/L染料的液体富集培养基(牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，蒸馏水IOOOmL)中培养，在35°C、250mL锥形瓶中装液量IOOmL培养基的条件下进行培养，培养时间为48h，培养后通过显微镜观察细菌生长情况以及测定溶液中染料的剩余浓度，从而确定出具有脱色活性偶氮染料特性的菌株。 该菌株在初始pH值为7. 0-8. 0，温度为35°C，250mL锥形瓶的装液量为IOOmL的条件下，菌株接种量为1%，染料初始浓度为50mg/L，培养时间48h，然后利用紫外分光光度法对染料浓度进行测定，测定波长为498nm ；染料的脱色率可达91. 4%。权利要求1.，包括(1)将活性染料污泥用无菌玻璃珠打散后制成的菌悬液接种于富集培养基中，使用含有不同浓度梯度的染料在富集培养基中驯化4周；(2)将驯化后的菌液，取OD值为1的菌液，做梯度稀释，每个稀释度的菌液均勻涂布到固体培养基上于35°C厌氧培养48h，重复此步骤直至固体培养基上长出的菌落大小均勻， 边缘清晰；将分离到的单菌落划线至含染料的固体培养基上，观察菌落生长情况，将其接种于含染料的液体培养基中，观察菌株脱色效果，将脱色效果好的菌株进行保藏，即得。2.根据权利要求1所述的，其特征在于所述步骤(1)中的富集培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，配方如下牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L， 氯化钠5g/L，蒸馏水1000mL。3.根据权利要求1所述的，其特征在于所述步骤(1)中的含有不同浓度梯度的染料为经滤菌的活性黑5、活性红239、活性蓝19或活性艳橙x-an，浓度梯度分别为50mg/L、100mg/L、150mg/L和200mg/L，改变浓度的时间间隔为7d。4.根据权利要求1所述的，其特征在于所述步骤(1)中的驯化条件为于35°C厌氧驯化。5.根据权利要求1所述的，其特征在于所述步骤⑵中的梯度稀释为10—1 10_7的梯度稀释。6.根据权利要求1所述的，其特征在于所述步骤O)中的固体培养基为步骤(1)中的牛肉膏蛋白胨培养基中加入17g/L的琼脂粉。7.根据权利要求1所述的，其特征在于所述步骤O)中的含染料的固体培养基配方为牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种脱色多种活性染料的细菌的筛选方法，包括：（１）将活性染料污泥用无菌玻璃珠打散后制成的菌悬液接种于富集培养基中，使用含有不同浓度梯度的染料在富集培养基中驯化４周；（２）将驯化后的菌液，取ＯＤ值为１的菌液，做梯度稀释，每个稀释度的菌液均匀涂布到固体培养基上于３５℃厌氧培养４８ｈ，重复此步骤直至固体培养基上长出的菌落大小均匀，边缘清晰；将分离到的单菌落划线至含染料的固体培养基上，观察菌落生长情况，将其接种于含染料的液体培养基中，观察菌株脱色效果，将脱色效果好的菌株进行保藏，即得。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：柳建设，于文娟，谢学辉，王兆慧，许贺，洪武林，张武刚，
申请(专利权)人：东华大学，
类型：发明
国别省市：31