本发明专利技术涉及筛选阿尔茨海默病治疗药物的模型的建立及应用，目的是提供于针对阿尔兹海默病症的发病进程的分子通路的研究，和进行药物筛选的转基因果蝇模型。本发明专利技术通过将现有的转基因果蝇连续杂交获得稳定可遗传的新型果蝇品系。该新型的疾病模型可以模拟阿尔兹海默病症主要致病基因在体内的产生和代谢过程，重现疾病的发病过程，并通过与病症密切相关的各种指标，包括生存曲线、行动能力、学习记忆指数以及体内实验证明该果蝇模型在各方面明显有别于其他阿尔茨海默病果蝇。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医药及生物领域，具体地说，本专利技术涉及一种研究阿尔茨海默病(AD) 致病基因APP在体内的剪切作用及其产物β -淀粉样蛋在发病过程中的分子机制以及筛选治疗AD的新药物的新型果蝇模型。
技术介绍
阿尔茨海默症(Alzheimer，s disease,AD)是一种中枢神经系统退行性疾病。近年来已成为仅次于血管病、癌症和脑卒中的第四大杀手。根据世界卫生组织的统计，目前全球阿尔茨海默症患病人数估计在1，800万左右。阿尔茨海默症病人临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征。AD的组织病理学表现主要为老年斑(senil印laques，SP)、神经原纤维缠结 (neurofibrillary tangles, NFI1s)，以及由凋亡引起的区域性神经细胞死亡等。其中淀粉样蛋白斑的主要成分是β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Αβ)。阿尔茨海默病的发病机制尚未十分清楚，目前主要有3种假说β淀粉样蛋白级联假说、Tau蛋白假说和血管源性假说。 其中，β淀粉样蛋白级联假说占主导地位，并且研究的较为成熟。β-淀粉样蛋白由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)经过β 分泌酶(0-secretase，BACE)和γ分泌酶(y-secretase)顺序剪切产生。脑内A β来源于其前体物质β淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)。从APP代谢为β 淀粉样蛋白肽过程分两步首先，分泌酶在Αβ的N末端裂解ΑΡΡ，产生可溶的分泌性的APP衍生物APPS-β和贯穿膜成分的C末端片段。C末端片段进一步由Y-分泌酶裂解为Αβ。在某些病理条件下，APP主要经β-分泌酶和Y-分泌酶顺序剪切产生过多的A β， 导致AD病。Y-分泌酶在Αβ产生中起非常重要作用，决定了产生的Αβ42在其中所占的比例。现在认为，此酶至少由presenilin、nicastrin、APHl和Pen2共4种跨膜蛋白组成。 Presenilin即早老蛋白，是Y _分泌酶的催化亚基，现已发现编码早老蛋白1的基因上的一百多个突变都能引起家族性老年痴呆，其致病机制很可能是因为突变体改变Y-分泌酶活性，增加A β 42产生的比例。在过去的几十年里，人们通过转基因小鼠模型成功的在动物身上模拟了多种神经退行性疾病，这使得人们对这些疾病以及治疗都有了深刻的理解。但是由于大多数应用于研究AD的转基因小鼠模型需要耗费大量的时间和金钱，严重的影响了研究的进展。从1918年发现利用果蝇模型研究黑色素沉着细胞瘤以来，人类利用果蝇模型已经在肿瘤、神经变性病、睡眠障碍、糖尿病、肥胖症等的研究方面取得重大突破。新的果蝇模型已用来研究遗传性痉挛性截瘫(Hereditary spastic paraplegia，HSP)、脊髓小脑型共济失调(Spinocerebellar ataxia, SCA)、白血病、PDGF/VEGF受体分子(PVR)基因等，而更多人类遗传及变性疾病都可以利用果蝇得到复制。转基因果蝇模型在研究以AD为代表的变性疾病方面具有许多独到的优势。首先在已知的人类714个遗传性疾病的致病基因中果蝇具有548个同源基因，如Amyloid percursor protein like (APPL)禾口 Presenilin (AD)、huntingtin (Huntington’ s disease, HD，亨廷顿氏病)等。除了具有大量的同源基因外，果蝇的神经退行性疾病模型与人类神经退行性疾病还有许多相似的表型，如迟发性(late onest)、进程性(progressive)、神经系统的高毒性。果蝇体内有一种与人类APP同源性的类似物-类淀粉前体蛋白类似物 (amyloide precursor protein like, APPL)，Luo 实验证实，敲除了 APPL 基因的果蝇在行为学表型方面的缺陷可以在转入了 APPL基因后有所改善。APPL基因突变的表达可以弥补大鼠行为学测试方面的不足，而同样也可以观察到APP基因突变后突触变性，轴突转运和细胞凋亡的改变。由于果蝇的生命周期短，使本专利技术人能够在很短的时间内就可以在果蝇模型上对神经退行性病变的全过程进行研究。由此可见，综合现有的Αβ果蝇模型和果蝇内源PSl蛋白与人的高度相似性等优势，在果蝇体内重建基于APP蛋白的剪切的Αβ的产生过程。这些已经建立的AD果蝇模型，重现了 AD病症的主要病理特征，包括寿命的缩短，行动能力的缺陷和学习记忆的缺陷， 同时可以检测到由于表达Αβ而造成的神经元毒性。Crowther等人证明ΜΚ-801，一种谷氨酸受体的拮抗剂可以延长AD果蝇的寿命。Iijima等人证明阻止Αβ沉积的物质刚果红可以显著的缓解AD果蝇的行为缺陷，及Αβ毒性造成的神经元损伤。因此，本专利技术人可以在果蝇中研究AD进程中A β和APP及相关分泌酶的相互作用，并进行针对此过程中参与的各种蛋白为靶点的药物筛选研究，进而揭示致病相关基因和阿尔茨海默症之间可能的联系。因此，本领域有必要开发新的适于实用的果蝇模型，从而有利于为AD的研究和治疗提供新的途径。
技术实现思路
本申请提供一种制备果蝇模型的方法，其特征在于，所述的方法包括(1)将UAS-APP品系果蝇与DB品系果蝇杂交，子代果蝇再与DB回交获得2号染色体为APP/Cyo、3号染色体为TM6B/TMII的果蝇；(2)将UAS-BACE品系果蝇与DB品系果蝇杂交，子代果蝇再与DB回交获得2号染色体为Bl/Cyo、3号染色体为BACE/TM6B的果蝇；(3)将步骤(1)和(2)得到的果蝇品系杂交，然后将所得2号染色体为APP/Cyo、3 号染色体为BACE/TM6B的子代果蝇再自交，获得2号染色体为纯合APP/APP、3号染色体为纯合BACE/BACE的可稳定遗传的果蝇；(4)将UAS-BACE ；DPsn品系果蝇与DB品系的果蝇杂交，再与DB品系回交，获得2 号染色体为Bl/Cyo、3号染色体为DPsn/TM6B的果蝇；(5)将步骤⑴所获得的果蝇与步骤⑷所获得的果蝇杂交，获得2号染色体为 APP/Cyo、3号染色体为DPsn/TM6B的果蝇；(6)将步骤(5)所获得的果蝇与步骤(3)获得的2号染色体为APP/Cyo、3号染色体为BACE/TM6B的子代果蝇杂交，获得2号染色体为APP/Cyo、3号染色体发生染色体重组 DPsn-BACE/DPsn-BACE的表现三性状的果蝇；(7)将步骤(6)所得的果蝇与DB杂交，获得2号染色体为APP/Cyo、3号染色体为 DPsn-BACE/TM6B 的果蝇；禾口(8)将步骤(7)所得果蝇自交，获得2号染色体为纯合APP/APP、3号染色体为纯合 DPsn-BACE/DPsn-BACE的可稳定遗传的果蝇，从而制得果蝇模型。在一个实施例中，所述方法还包括(9)将步骤(8)中获得的果蝇与DB杂交，获得子代果蝇与+/+ ；TM6B/TMII杂交后回交一次，所得到子代果蝇的2号染色体为+/+，3号染色体为DPsn-BACE/lFsn-BACE ；所述的果蝇只表达β -分泌酶和早老素蛋白但不表达底物蛋白ΑΡΡ，由此制得本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种制备果蝇模型的方法，其特征在于，所述的方法包括：（１）将ＵＡＳ－ＡＰＰ品系果蝇与ＤＢ品系果蝇杂交，子代果蝇再与ＤＢ回交获得２号染色体为ＡＰＰ／Ｃｙｏ、３号染色体为ＴＭ６Ｂ／ＴＭＩＩ的果蝇；（２）将ＵＡＳ－ＢＡＣＥ品系果蝇与ＤＢ品系果蝇杂交，子代果蝇再与ＤＢ回交获得２号染色体为Ｂ１／Ｃｙｏ、３号染色体为ＢＡＣＥ／ＴＭ６Ｂ的果蝇；（３）将步骤（１）和（２）得到的果蝇品系杂交，然后将所得２号染色体为ＡＰＰ／Ｃｙｏ、３号染色体为ＢＡＣＥ／ＴＭ６Ｂ的子代果蝇再自交，获得２号染色体为纯合ＡＰＰ／ＡＰＰ、３号染色体为纯合ＢＡＣＥ／ＢＡＣＥ的可稳定遗传的果蝇；（４）将ＵＡＳ－ＢＡＣＥ；ＤＰｓｎ品系果蝇与ＤＢ品系的果蝇杂交，再与ＤＢ品系回交，获得２号染色体为Ｂ１／Ｃｙｏ、３号染色体为ＤＰｓｎ／ＴＭ６Ｂ的果蝇；（５）将步骤（１）所获得的果蝇与步骤（４）所获得的果蝇杂交，获得２号染色体为ＡＰＰ／Ｃｙｏ、３号染色体为ＤＰｓｎ／ＴＭ６Ｂ的果蝇；（６）将步骤（５）所获得的果蝇与步骤（３）获得的２号染色体为ＡＰＰ／Ｃｙｏ、３号染色体为ＢＡＣＥ／ＴＭ６Ｂ的子代果蝇杂交，获得２号染色体为ＡＰＰ／Ｃｙｏ，３号染色体发生染色体重组ＤＰｓｎ－ＢＡＣＥ／ＤＰｓｎ－ＢＡＣＥ的表现三性状的果蝇；（７）将步骤（６）所得的果蝇与ＤＢ杂交，获得２号染色体为ＡＰＰ／Ｃｙｏ、３号染色体为ＤＰｓｎ－ＢＡＣＥ／ＴＭ６Ｂ的果蝇；和（８）将步骤（７）所得果蝇自交，获得２号染色体为纯合ＡＰＰ／ＡＰＰ、３号染色体为纯合ＤＰｓｎ－ＢＡＣＥ／ＤＰｓｎ－ＢＡＣＥ的可稳定遗传的果蝇，从而制得果蝇模型。...
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：裴钢，赵简，刘佳，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：31
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