本发明专利技术涉及使用腈水解酶突变体生产3-羟基羧酸。本发明专利技术涉及具有改善的用于将3-羟基腈转化为3-羟基羧酸的腈水解酶活性的腈水解酶突变体。更具体地说，使用易错PCR和位点定向诱变突变敏捷食酸菌72W(ATCC?55746)腈水解酶基因以产生具有改善的用于将3-羟基腈(如3-羟基丁腈或3-羟基戊腈)转化为相应的3-羟基羧酸的腈水解酶活性的腈水解酶。也提供了一种使用所述改善的突变体生产3-羟基羧酸的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学和微生物学领域。更具体地说，本专利技术涉及具有改善的腈水解酶活性的突变的腈水解酶，所述腈水解酶用于将3-羟基腈转化为3-羟基羧酸。
技术介绍
具有优异性能、独特性质、改善的成本效率、品质以及低生态影响的新聚合物正引起工业界的注意。特别是，需要具有支链、致密结构以及末端带反应基的功能聚合物，因为与常规线型统计共聚物相比，它们具有更低的特性粘度和更高的活性。这样优异的聚合物可通过共聚高支化(hyperbranching)羟基羧酸共聚单体(高支化ABn型，其中A和B是具有羟基或羧基衍生的反应基部分，η是2或更大)(Hult等， pp. 656-658 禾口 Voit 等，pp.658-659 inConcise Polymeric Materials Encyclopedia,^m 辑.J. C. Salomone, CRC Press, New York, 1999)和多种线型羟基羧酸共聚单体(线型AB 型)包括3-羟基戊酸(3-HVA)和3-羟基丁酸(3-HBA)得以制备。3-羟基羧酸用作为共聚单体用于制造线型聚酯。聚酯被用作为热塑性、热固性、半结晶、非晶形、刚性和弹性体材料。它们是纤维、薄膜、模制品和涂料的主要成分(Goodman， pp.793-799 in Concise Encyclopedia of Polymer Science and EnRineerinR, 编车t. J. I.Kroschwitz, John Wiley&Sons，New York,1990)。已在使用皱落假丝酵母(Candida rugosa)的发酵中通过戊酸的3_羟基化作用制备了 3-羟基戊酸(Hasegawa 等，J. Ferment. Technol. 59 :257-262(1981) JP 59053838B4)，并且通过使用恶臭假单胞菌(I^seudomonas putida)、产蓝色素荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、氧化节杆菌(Arthrobacter oxydans)禾口 Arthrobacter crystallopietes，经发酵的戊酸的3-羟基化作用，类似地制备了 3_羟基戊酸的单一对映体(U. S. 3，553，081)。这些用于戊酸发酵氧化的方法通常产生低产物浓度的3-羟基戊酸，并且从发酵培养基中分离3-羟基戊酸需要精心设计且费用昂贵。已通过化学降解 (Seekich 等，HeIv. CMm. Acta 77:2007-2034(1994))或聚(3-羟基丁酸酯/3-羟基戊酸酯)发酵自降解(W0 9929889)制备得到(R) _ (_) _3_羟基戊酸，但是羟基丁酸/羟基戊酸共聚物的降解同样需要费力地将3-羟基丁酸与副产物3-羟基戊酸分离。还已通过酶促还原 3-氧代戊酸(Bayer 等，Appl. Microbiol. Biotechnol. 42 :543-547 (1994))或不对称氢化甲基3-氧代戊酸酯接着皂化(Burk等，Organometallics 9 :2653-2655(1990))制备得到(R)-(-)-3-羟基戊酸。通过多种化学方法，腈容易地转化为相应的羧酸。这些方法需要强的酸性和碱性反应条件和高反应温度，且通常产生不需要的副产物和/或作为不需要的废弃物的大量无机盐。用于化学水解额外具有羟基的腈的反应条件，例如用于将3-羟基戊腈转化为3-羟基戊酸的反应条件，通常会导致不期望的伯、仲或叔羟基消除，产生碳-碳双键。腈酶催化水解为相应的羧酸是经常优选的化学方法，因为该反应通常在环境温度下进行，无需强的酸性或碱性反应条件，并以高转化率产生高选择性的所需产物。两种酶——腈水合酶和酰胺酶的组合可用于在水溶液中将脂肪腈转化为相应的羧酸。开始，通过腈水合酶将脂肪腈转化为酰胺，接着，随后通过酰胺酶将酰胺转化为相应的羧酸。已知多种细菌菌属具有不同的腈水合酶和酰胺酶活性谱(Sugai等，Biosci. Biotech. Biochem. 61 1419-1427(1997))，包括红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、产硫杆菌属(Alcaligenes)、节核细菌属(Arthrobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、无芽孢杆菌属(Bacteridium) lifM (Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)禾口微球菌属(Micrococcus)。真菌节镰孢(Fusarium merismoides) TG-I还已用作为催化剂用于水解脂肪腈和二腈(Asano 等，Agric. Biol. Chem. 44 =2497-2498 (1980)) 来自红球菌 (Rhodococcus sp.)(来自Novo Industri的SP409)的固定化腈水合酶和酰胺酶被用于将 3-羟基丙腈、3-羟基庚腈和3-羟基壬腈水解为相应的3-羟基羧酸，产率分别为63%、62% 和 83% (de Raadt 等，J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1，137-140 (1992))。使用 TLC 也观察到了相应的酰胺的形成。与此相反，苍白芽孢杆菌(Bacillus pallidas)Dac521的纯化的腈水合酶水解多种脂肪腈，但不水解3-羟基丙腈(Cramp等，Biochim. Biophys. Acta 1431 249-260(1999))。单种酶一腈水解酶在水溶液中也将腈转化为相应的羧酸和氨，但没有酰胺中间体形成(方程式1和2)。.OΜ、 n晴水解酵 ^ //⑴ R—⑶R—\ + ^nOH(2) R-CN+ NH3H2O\ Η,Ο\3NH2 -OH Kobayashi 等(Tetrahedron 46:5587—5590(1990)禾口 J. Bacteriologyl72 4807-4815(1990))已描述了一种分离自紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)K22 的脂族腈水解酶，其催化多种脂肪腈水解为相应的羧酸。业已分离了来自睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)的腈水解酶，其能将一系列脂族α，ω-二腈转化为相应的ω-氰羧酸或二羧酸(CA 2，103,616 ;Levy-Schil 等，Gene 161 15-20 (1995))。还利用紫红红球菌 NCIMB 11216 (Bengis-Garber 等，Appl. Microbiol. Biotechnol. 32 :11-16(1989)；Gradley 等，Biotechnology Lett. 16 :41-46 (1994))、紫红红球菌 PA-34 (Bhalla 等，Appl. Microbiol. Biotechnol. 37 :184-190(1992))、尖镰孢(Fusarium oxysporum f. sp.melonis) (Goldlust 等，Biotechnol. Appl. Biochem. 11 :581-601 (1989))、不动杆菌(Acinetobacter sp. )A本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７所示的分离的核酸分子。
【技术特征摘要】
2004.08.16 US 10/9191821.如SEQID NO :7所示的分离的核酸分子。2.一种包含可操作地连接有合适的调节序列的权利要求1的分离的核酸分子的嵌合基因。3.一种包含权利要求2的嵌合基因的表达盒。4.一种包含权利要求2的嵌合基因的转化的微生物。5.一种包含权利要求3的表达盒的转化的微生物。6.权利要求4的转化的微生物，其中所述微生物选自丛毛单胞菌(Comamonassp.)、 棒状杆菌(Corynebacterium sp.)、fei|f菌(Brevibacterium sp·)、红球菌(Rhodococcus sp·)、固氮菌(Azotobacter sp.)、梓樣酸杆菌(Citrobacter sp.)、肠杆菌(Enterobacter sp.)、梭状芽孢杆菌(Clostridium sp.)、克雷白氏杆菌(Klebsiella sp.)、沙门氏菌 (Salmonella sp.)、乳酸杆菌(Lactobacillus sp.)、曲霄(Aspergillus sp·)、糖酵母 (Saccharomyces sp.)、接合酵母(Zygosaccharomyces sp.)、毕赤氏酵母(Pichia sp.)、 克鲁维氏酵母(Kluyveromyces sp.)、假丝酵母(Candida sp.)、汉森氏酵母(Hansenula sp.)、杜氏藻(Dunaliella sp.)、德巴利氏酵...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·S·佩恩，R·迪科西莫，D·P·奥基夫，
申请(专利权)人：纳幕尔杜邦公司，
类型：发明
国别省市：US
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