本发明专利技术公开了一种检测碱木质素酶解过程中漆酶吸附特性的方法，包括以下步骤：向碱木质素溶液中，添加漆酶—胶体金探针和ABTS，所述漆酶—胶体金探针包括漆酶，所述漆酶表面结合有粒径为15nm～20nm、Zeta电位为-30.5mV～-35.5mV的胶体金颗粒，调节pH值为4.0～5.0，调节溶液中漆酶—胶体金探针的酶活性浓度不小于20U/g，ABTS的添加量为5mg/L～20mg/L，在30℃～40℃温度条件下振荡培养4～6天后，离心并取上清液真空冷冻干燥后，电镜水平检测漆酶—胶体金探针吸附于碱木质素的位点及吸附量，完成对漆酶吸附特性的检测。本发明专利技术具有成本低廉、操作方便的优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种检测漆酶吸附特性的方法。
技术介绍
木质素是农作物秸杆及城市生活垃圾中一种常见的、难降解的物质，处理不当会造成极大的资源浪费和环境污染。白腐菌是降解木质素一类有机污染物能力最强的微生物，它在分解木质素的过程中会产生氧化及分解木质素的酶系统，主要包括木质素过氧化 ^lJBl(Lignin Peroxidases)>Mil^ftliItlBI(Manganese Perxidases)禾口(Laccase)0 它们决定着木质素降解的途径、速度和程度，因此木质素降解过程中微生物的酶解作用便成为关键。木质素的组成单位和空间结构决定了其酶解过程的复杂性，而酶在木质素表面的吸附是酶降解底物的第一步。木质素组成成分复杂，各成分对酶的吸附特性不一，在生产中，酶液与底物的合理比例关系就是依据酶在底物上的吸附特性而确定的，因而酶的吸附特性对工业化生产也具有指导作用，可为设计和选择生化反应器提供最优参数。这样通过实时监测不同基质条件变化下木质素降解酶的吸附作用位点来检测其吸附特性，对深入了解木质素降解酶的作用机制，促进木质素的酶解作用显得尤为重要。首先，木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶是在既限碳，又限氮条件下产生的严格次级代谢产物，碳、氮源营养物的存在会限制细胞对酶的分泌；其次，由于木质素过氧化物酶和锰过氧化物在降解有机污染物时需要大量的H2O2辅助剂，这在现实情况下很难实现， 限制了其在实际生产中的应用；第三，漆酶具有780mV氧化还原电位，能把分子氧直接还原为水，即使没有H2O2和其它次级代谢产物存在下，也可催化有机污染物的氧化。因此，漆酶的吸附特性检测更具实际意义。目前对于漆酶的吸附特性研究普遍停留在酶的吸附热力学、测定吸附等温线和建立吸附热力学模型以及测定和建立酶解动力学等基础工作上，因此研究一种通过微观定位酶的吸附作用位点来检测其吸附特性的方法，成为极需解决的的问题。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种成本低廉、操作方便且能够特异性地检测漆酶的吸附位点及数量，实现。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案一种，包括以下步骤 向碱木质素溶液中，添加漆酶一胶体金探针和ABTS2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐，所述漆酶一胶体金探针包括漆酶，所述漆酶表面结合有粒径为15 nm 20 nm、Zeta电位为-30. 5 mV -35. 5 mV的胶体金颗粒，调节pH值为4. 0 5. 0， 调节溶液中漆酶一胶体金探针的酶活性浓度不小于20 U/g，ABTS的添加量为5 mg/L 20mg/L,在30°C 40°C温度条件下振荡培养4 6天后，离心并取上清液真空冷冻干燥后，电镜水平检测漆酶一胶体金探针吸附于碱木质素的位点及吸附量，完成对漆酶吸附特性的检测。作为本专利技术的方法的进一步改进上述的方法中，所述离心的工艺参数优选为转速为9000 r/min，温度为4°C条件下离心至少10 min。上述的方法中，所述振荡培养的条件优选为摇床转速为150 200 r/min。上述的方法中，所述漆酶一胶体金探针是通过以下步骤制备得到的制备胶体金溶液并将其PH值调节为4. 5 5，向胶体金溶液中加入质量浓度不小于 0.9 mg/mL的漆酶溶液，在搅拌条件下加入质量浓度为5 mg/mL 10 mg/mL的PEG-20000溶液，所述胶体金溶液、漆酶溶液与PEG-20000溶液的体积比为5 (1.1 1.15): (0. 6 0.65)，充分反应后，用1000 r/min 1200 r/min的转速进行第一次离心，去除聚集物，再以13000 r/min 15000 r/min的转速进行第二次离心，吸弃上清液，将沉淀重溶于柠檬酸钠缓冲溶液，定容，制得所述漆酶一胶体金探针。上述的方法中，所述柠檬酸钠缓冲溶液中含有浓度为0. 2 mg/mL的PEG-20000。与现有技术相比，本专利技术的优点在于本专利技术的，成本低廉、操作方便，能够适应底物条件变化，特异性地检测漆酶的吸附位点及数量，能为酶液与底物的合理比例关系的确定提供依据，可为设计和选择生化反应器提供最优参数。附图说明图1是本专利技术的漆酶一胶体金探针吸附于碱木质素上的扫描电镜图谱。 具体实施例方式以下将结合说明书附图和具体实施例对本专利技术做进一步详细说明。本专利技术的，包括以下步骤 1、制备漆酶一胶体金探针a.胶体金的制备取质量浓度为0.01%的HAuCl4水溶液100 mL于恒温磁力搅拌器上加热至沸腾并保持2 min，在1000 r/min的转速条件下，快速加入浓度为10 g/L柠檬酸三钠溶液6 mL。保持温度与转速，直至溶液颜色转为清亮橘红色后停止加热，继续搅拌15 min，室温冷却后以去离子水回复到原体积，制得胶体金溶液。所制胶体金粒径为15 nm 20 nm, Zeta电位为-30. 5 mV -35. 5 mV。b.漆酶一胶体金探针的制备用0.1 M乙酸将上述步骤制得的胶体金溶液PH值调节为5.0，逐滴加入0.9 mg/mL漆酶溶液并混合均勻，其中胶体金与漆酶溶液的体积比为5 1. 1，在搅拌下逐滴加入10 mg/mL 的PEG-20000溶液2 mL于20 mL上述混合溶液中。搅拌标记20 min后，先按1200 r/min 离心20 min并去除聚集物，再以15000 r/min离心1 h，轻吸弃去上清液，沉淀重溶于22 mL 的0. 1 M柠檬酸钠缓冲溶液，该柠檬酸钠缓冲溶液中含有浓度为0. 2 mg/mL的PEG-20000，完成标记过程，制得彻底去除未结合蛋白质的漆酶一胶体金探针。2.碱木质素酶解过程中漆酶吸附特性的检测取100 mL的300 mg/L的碱木质素溶液，调节制备得到的漆酶一胶体金探针的酶活性浓度，并加入6 mL漆酶一胶体金探针及ABTS于碱木质素溶液中，调节最终碱木质素溶液中漆酶一胶体金探针的酶活性浓度为30 U/g，并调节体系的pH值为4. 0、ABTS浓度为10 mg/ L ；温度控制在30°C 40°C振荡(摇床转速为150 r/min)培养4 6天后，于转速为9000 r/min、温度为4°C条件下离心10 min，取上清液并真空冷冻干燥后，进行电镜水平检测漆酶一胶体金探针的吸附位点及吸附量，完成对漆酶吸附特性的检测。上述步骤中，漆酶一胶体金探针的酶活性浓度、pH值调节范围及ABTS添加量范围是通过正交实验确定的，具体包括以下步骤取100 mL的300 mg/L的碱木质素溶液，调节制备得到的漆酶一胶体金探针的酶活性浓度，分别加入6 mL漆酶一胶体金探针及ABTS于碱木质素溶液中，按表1的实验方案调节最终碱木质素溶液中漆酶一胶体金探针的酶活性浓度，并调节体系的PH值配成系列溶液； 温度控制在30°C 40°C振荡培养4 6天后，转速为9000 r/min、温度为4°C条件下离心 10 min，取上清液，用紫外分光光度计在280 nm下测定剩余碱木质素浓度，并干燥所取上清液并进行电镜水平检测漆酶一胶体金探针吸附于碱木质素的位点及吸附量。 表1不同碱木质素酶解条件对漆酶一胶体金探针吸附量的影响本文档来自技高网...
【技术保护点】
１． 一种检测碱木质素酶解过程中漆酶吸附特性的方法，包括以下步骤：向碱木质素溶液中，添加漆酶—胶体金探针和ＡＢＴＳ，所述漆酶—胶体金探针包括漆酶，所述漆酶表面结合有粒径为１５ ｎｍ～２０ ｎｍ、Ｚｅｔａ电位为－３０．５ ｍＶ～－３５．５ ｍＶ的胶体金颗粒，调节ｐＨ值为４．０～５．０，调节溶液中漆酶—胶体金探针的酶活性浓度不小于２０ Ｕ／ｇ，ＡＢＴＳ的添加量为５ ｍｇ／Ｌ～２０ ｍｇ／Ｌ，在３０℃～４０℃温度条件下振荡培养４～６天后，离心并取上清液真空冷冻干燥后，电镜水平检测漆酶—胶体金探针吸附于碱木质素的位点及吸附量，完成对漆酶吸附特性的检测。
【技术特征摘要】
1.一种检测碱木质素酶解过程中漆酶吸附特性的方法，包括以下步骤向碱木质素溶液中，添加漆酶一胶体金探针和ABTS，所述漆酶一胶体金探针包括漆酶， 所述漆酶表面结合有粒径为15 nm 20 nm、Zeta电位为-30. 5 mV -35. 5 mV的胶体金颗粒，调节PH值为4. 0 5. 0，调节溶液中漆酶一胶体金探针的酶活性浓度不小于20 U/g， ABTS的添加量为5 mg/L 20 mg/L,在30°C 40°C温度条件下振荡培养4 6天后，离心并取上清液真空冷冻干燥后，电镜水平检测漆酶一胶体金探针吸附于碱木质素的位点及吸附量，完成对漆酶吸附特性的检测。2.根据权利要求1所述的检测碱木质素酶解过程中漆酶吸附特性的方法，其特征在于，所述离心的工艺参数为转速为9000 r/min，温度为4°C条件下离心至少10 min。3.根据权利要求1所述的检测碱木质素酶解过程中漆酶吸附特性的方法，其特征在于，所述振荡培养时的摇床转速为150 r/min...
【专利技术属性】
技术研发人员：曾光明，赖萃，黄丹莲，冯冲凌，赵美花，危臻，黄超，李宁杰，许飘，王聪，
申请(专利权)人：湖南大学，
类型：发明
国别省市：43
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