一种减毒沙门氏菌传递鸡γ干扰素的制备方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，特别公开了一种减毒沙门氏菌传递鸡γ干扰素的制备方法。该减毒沙门氏菌传递鸡γ干扰素的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：鸡γ干扰素（chIFN-γ）的成熟蛋白的基因序列的扩增；重组真核表达质粒的获得；重组真核质粒表达的chIFN-γ活性单位检测；重组质粒pVAX1?-chIFN-γ电转化入减毒沙门氏菌获得菌种。本发明专利技术由减毒沙门氏菌传递chIFN-γ，可有效避免鸡口服干扰素后易被胃酸降解、蛋白纯化步骤繁琐等问题，此种chIFN-γ可以通过细菌发酵的方法制取，具有易贮藏等优点，对鸡具有明显的NDV保护力，可以为规模化鸡场新城疫等病毒性疾病的预防和治疗提供保障。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，特别涉及一种减毒沙门氏菌传递鸡Y干扰素的制备方法。
技术介绍
IFN可分为两个型(I型和II型)，IFN- α、β属于I型干扰素，IFN- Y属于II型干扰素，具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节作用。1995年Digby和Lowenthal首次成功地克隆出鸡 IFN- y (chIFN- γ )后，国内外学者通过大肠杆菌、酵母、杆状病毒等表达系统对chIFN- γ 做了大量研究。本课题组也曾将chIFN-γ克隆入原核表达载体pET3h中，但是表达的蛋白纯化步骤繁琐、在胃容易被胃酸破坏等缺点。
技术实现思路
本专利技术为了弥补现有技术的不足，提供了一种对鸡具有明显的抗新城疫病毒 (NDV)的减毒沙门氏菌传递鸡γ干扰素的制备方法，它以真核质粒pVAXl°为载体表达鸡 Y干扰素(chIFN-γ )具有很高的抗VSV活性，并将重组质粒电转化入减毒沙门氏菌获得菌种。本专利技术是通过如下技术方案实现的一种减毒沙门氏菌传递鸡Y干扰素的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)鸡Y干扰素(ChIFN-Y)的成熟蛋白的基因序列的扩增；(2)重组真核表达质粒的获得；(3)重组真核质粒表达的chIFN-γ活性单位检测；(4)重组质粒pVAXl°-chIFN-γ电转化入减毒沙门氏菌获得菌种。该减毒沙门氏菌传递鸡Y干扰素的制备方法，还包括给鸡口服传递chIFN-γ的减毒沙门氏菌后攻毒保护试验将减毒沙门氏菌培养增殖后给鸡口服，第一天和第二天各口服一次，剂量为IO8Cfu，第3天以50 LD50的新城疫病毒NDV攻毒。该减毒沙门氏菌传递鸡Y干扰素的制备方法，其特征在于包括如下步骤 (1-1)引物的设计及合成；(1-1-1)根据 GenBank 公布的 ChIFN-γ 的基因序列(GenBank no. AY501004),采用一对扩增chIFN-γ成熟蛋白的基因序列的特异性引物，在引物chlFN-Y-Fwd的5’端引入 ^coRI酶切位点和Kozak序列，在引物chIFN- y -Rev的5，端引入炀οI酶切位点，引物序列如下chIFN-γ-Fwd: 5’ -TATGAATTCGGTACCACCATGGGACATACTGCAAGTAGT-3’ chIFN-y-Rev:5’ -GAGCTCGAGAAGCTTATTAGCAATTGCATCTC-3’ ；(1-2)从鸡的脾淋巴细胞提取总RNA，采用RT-PCR技术扩增出chIFN-γ的成熟蛋白 cDNA的PCR产物；(2)用&ORI和损ol双酶切pVAXl°，胶回收载体片段，与同样经过双酶切并胶回收的chlFN-y成熟蛋白基因的PCR产物在16° C过夜连接，转化DH5 α感受态细菌，筛选出阳性克隆 pVAXl°-chIFN-γ ；(3-1)重组质粒 pVAXl°-chIFN- γ 转染 ΗΕΚ493Α 细胞；(3-1-1)将1. 0μδ重组真核质粒pVAXl°-chIFN- γ转染ΗΕΚ493Α细胞，24h后反复冻融细胞转染物3次，12000rpm离心lOmin，取上清孵育鸡胚成纤维细胞，24h后接毒IOOTCID5q 的 VSV ；(3-2)重组质粒pVAXl°-chIFN- γ表达的chIFN- Y蛋白抗VSV活性检测； (3-2-1)用VSV检测IFN的活性单位高达1 X 106 °U/0. Iml ；(4)将0. μδ重组真核质粒电转化入减毒沙门氏菌的感受态细胞中，涂布卡那霉素抗性平板，获得减毒沙门氏菌菌株。本专利技术减毒沙门氏菌传递鸡Y干扰素的制备方法，通过RT-PCR技术扩增出鸡γ 干扰素(chIFN- y )的成熟蛋白的cDNA序列，将基因克隆入真核质粒表达载体pVAXl°中，获得了重组真核表达质粒pVAXl°-chIFN- Y，将该重组真核质粒转染ΗΕΚ493Α细胞，通过水泡性口炎病毒(VSV)抑制试验证实了表达的chIFN-γ具有很好的抗病毒活性。将该重组真核质粒电转化入减毒沙门氏菌，无特定病原体(SPF)鸡口服后能够抵抗新城疫病毒NDV的感染。本专利技术由减毒沙门氏菌传递chIFN- γ，可有效避免鸡口服干扰素后易被胃酸降解、蛋白纯化步骤繁琐等问题，此种chIFN-γ可以通过细菌发酵的方法制取，并且减毒沙门氏菌的贮藏方法简单，因此具有适合规模化生产、易贮藏等优点，对鸡具有明显的抗新城疫病毒NDV保护力，可以为规模化鸡场新城疫等病毒性疾病的预防和治疗提供保障。附图说明下面结合附图对本专利技术作进一步的说明。图1为ChIFN-Y成熟蛋白基因克隆入pVAXl°的示意图； 图2为重组质粒pVAXl°-chIFN- YEcoRl/Xhol双酶切鉴定结果。M1 kb plus DNA Marker ； 1 chIFN- γ的PCR产物对照；2:重组阳性质粒pVAXl -chIFN-Y RI/IAoI双酶切。具体实施方式实施例1 该减毒沙门氏菌传递鸡Y干扰素的制备方法，包括如下步骤 (1)鸡Y干扰素(ChIFN-Y)的成熟蛋白的基因序列的扩增 (1-1)引物的设计及合成(1-1-1)根据 GenBank 公布的 ChIFN-Y 的基因序列(GenBank no. AY501004),设计一对扩增chIFN-γ成熟蛋白的基因序列的特异性引物。在引物chIFN-γ-Fwd的5’端引 A^oRI酶切位点和Kozak序列，在引物chIFN- y -Rev的5，端引入炀οI酶切位点，引物序列如下chIFN-γ-Fwd: 5’ -TATGAATTCGGTACCACCATGGGACATACTGCAAGTAGT-3’ chIFN-y-Rev:5，-GAGCTCGAGAAGCTTATTAGCAATTGCATCTC-3，上下游引物横跨chIFN-γ成熟蛋白编码区，预计扩增片段长度为480bp左右，引物由宝生物工程(大连)有限公司合成；(1-2)无菌采集健康鸡的脾脏，用淋巴细胞分离液分离脾淋巴细胞，用10%胎牛血清的 1640液在37°C 5%的(X)2培养lh。然后加入50(^g/mL的PHA刺激1 后，用TRIzol试剂提取总RNA，作为RT-PCR的模板；经Oligo (！⑴反转录后以cDNA为模板，以chIFN-γ-Fwd/ chIFN- y -Rev 为引物在进行 PCR 扩增，体系为 25μ :cDNA μ , Mg2+ 1. 5mmol/L, dNTP 200Mmol/L, 10XLA PCR Buffer 2. 5μ ，chIFN-γ-Fwd/chlFN-γ-Rev浓度均为 400nmol/L， TaKaRa LA Taq 2U。反应条件为预变性95。C 5min ；95° C 45s, 62° C 45s, 72° C 45S，共进行 35个循环；然后72°C延伸lOmin，取出产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳。这样采用RT-PCR 技术扩增出了 chIFN- γ的成熟蛋白cDNA的PCR产物；(2)重组真核表达质粒的获得胶回收获得chIFN-γ成熟蛋白基因的PCR产物，用和损ol双酶切载体pVAXl° 并胶回收载体片段，与同样经过双酶切的chIFN-γ成熟蛋白基因的PCR产物在16°C过夜连接，转化DH5 α感受态细菌，37° C过夜培养16h。挑取菌落于卡那霉素本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种减毒沙门氏菌传递鸡γ干扰素的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：（１）鸡γ干扰素ｃｈＩＦＮ－γ的成熟蛋白的基因序列的扩增；（２）重组真核表达质粒的获得；（３）重组真核质粒表达的ｃｈＩＦＮ－γ活性单位检测；（４）重组质粒ｐＶＡＸ１？－ｃｈＩＦＮ－γ电转化入减毒沙门氏菌获得菌种。

【技术特征摘要】
1.一种减毒沙门氏菌传递鸡Y干扰素的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)鸡Y干扰素ChIFN-γ的成熟蛋白的基因序列的扩增；(2)重组真核表达质粒的获得；(3)重组真核质粒表达的chIFN-γ活性单位检测；(4)重组质粒pVAXl°-chIFN-γ电转化入减毒沙门氏菌获得菌种。2.根据权利要求1所述的减毒沙门氏菌传递鸡Y干扰素的制备方法，其特征在于还包括给鸡口服传递chIFN-γ的减毒沙门氏菌后攻毒保护试验将减毒沙门氏菌培养增殖后给鸡口服，第一天和第二天各口服一次，剂量为108cfu，第3天以50 LD50的新城疫病毒 NDV攻毒。3.根据权利要求1所述的减毒沙门氏菌传递鸡Y干扰素的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1-1)引物的设计及合成；(1-2)从鸡的脾淋巴细胞提取总RNA，采用RT-PCR技术扩增出chIFN-γ的成熟蛋白 cDNA的PCR产物；(2)用&ORI和损ol双酶切pVAXl°，胶回收载体片段，与同样经过双酶切并胶回收的 chlFN-y成熟蛋白基因的PCR产物在16° C过夜连接，转化DH5 α感受态细菌，筛选出阳性克隆 pVAXl°-chIFN-γ ；(3-1)重组质粒 pVAXl°-chIFN- γ 转染 ΗΕΚ493Α 细胞； (3-2)重组质粒pVAXl...

【专利技术属性】
技术研发人员：张旭东，李玲，
申请(专利权)人：山东步步赢生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：37