一种双基因协同修饰的组织工程化骨及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种组织工程化骨，具体地说关于一种双基因协同修饰的组织工程化骨及其应用。本发明专利技术的技术方案如下：一种Ｎｅｌｌ－１与ＢＭＰ－２协同修饰ｂＭＳＣｓ构建组织工程化骨，它由下列方法制得：（１）腺病毒介导的Ｎｅｌｌ－１与ＢＭＰ－２基因协同转染体外培养的骨髓基质细胞；（２）将步骤（１）得到的产物、生物支架材料构建组织工程化骨修复大鼠下颌骨临界骨组织缺损。本发明专利技术优点表现在：Ｎｅｌｌ－１与ＢＭＰ－２基因协同修饰的组织工程化骨修复大鼠临界骨组织缺损，材料网孔内新骨成骨多，新骨形成效果优于Ｎｅｌｌ－１或ＢＭＰ－２单独修饰的组织工程化骨。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种组织工程化骨，具体地说关于一种双基因协同修饰的 组织工程化骨及其应用。
技术介绍
骨形成蛋白(BMP)属于转化生长因子超家族，其中BMP2 、 4 、 5 、 6 、 7等与骨、软骨、肌腱、牙周组织、牙本质的形成有极为密切的关系，均 有明确的诱导成骨的作用。但传统的BMP蛋白制备,无论是从骨基质中提 纯，还是用基因工程表达，程序复杂，产量低，活性不稳定;在修复大面积骨 缺损时，BMP的用量大,可能会生毒性反应；BMP作为外源性蛋白植入体内， 也可能引起免疫反应。近年有学者探索应用BMP基因治疗的方法加速骨 缺损的修复。1988年Wozney等首先克隆出hBMPl-4cDM。随后陆续克隆 获得了 BMP家族中的其它成员，为骨缺损修复的BMP基因治疗奠定了基 础。BMP基因转移的载体各有特点，反转录病毒能将目的基因整合到靶细 胞基因组中，可长期表达，腺病毒不论靶细胞增殖状况均可高效转移，介导 的基因转移是非整合型的；棵DNA直接转导方法简单，无免疫原性，安全， 费用低,缺点是转导效率低。应用BMP基因治疗结合组织工程技术促进新骨的形成已成为目前骨再生领域的研究热点。Nell-l (Nel样I型分子)是具有成骨能力的新基因，与颅缝早闭有 关。Nell-l编码90kDa的多肽，并最终形成三聚体分泌到胞外，种系间基 因序列高度保守。最近的研究显示，Nell-l促进成骨的能力较强。Nell-1 在一定的范围内成骨能力与BMP-2相当。有意思的是该基因可以促进成骨 细胞的分化以及成骨分化终末阶段所伴随的凋亡，而对成纤维细胞系或原 代的成纤维细胞却没有作用，其作用部位可能是在成骨信号通路的下游， 或者通过与BMP成骨作用不同的机制促进成骨。BMPs与Nel卜l促进成骨的机制有所不同BMPs是通过细胞膜受体， SMAD蛋白、Cbf a-l转录因子启动成骨；而Nell-1目前认为它处于成 骨转录因子Cbf a-l的下游。发现Nell-l与BMP-2协同促进骨髓基质 细胞成骨将有助于揭示成骨信号通if各中的某些才几制。Nell-1与BMPs强 大的协同成骨能力，还可以用来修复大块的骨组织缺损，并可能减少因 为大量4吏用BMP造成的全身系统性毒副作用。应用Nell-l与BMPs协同 修饰bMSCs复合生物支架材料构建组织工程化骨具有良好的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于(1)提供一种Nel卜l与BMP-2协同》务饰bMSCs构建组织工程化骨； (2 )提供组织工程化骨用途。本专利技术的目的是通过以下技术方法来实现的本专利技术的目的是通过以 下技术方法来实现的选择Nell-l与BMP-2基因协同转染体外培养扩增的大鼠bMSCs， Nel卜l基因是成骨能力较强的新基因，目前的研究认为在 细胞水平上，Nel卜l单独诱导一定程度的成骨分化，它可能操纵了一些 成骨相关基因的下游途径，并影响了其他信号通^各,促进成骨细胞的分化。 作为一种新克隆的成骨相关基因，Nell-l具有潜在的安全性以及明显的 成骨作用，它的产物蛋白可能成为骨组织工程中一种新的生长因子。骨形成蛋白(BMP)属于TGF-P超家族，其中BMP-2、 4、 7等均有明 确的独立诱导成骨能力。Wozney于1988年首先克隆出BMP-2、 4基因， 从而为骨缺损修复的BMP基因治疗奠定了 _^5出。BMP基因治疗较传统方法 直接应用BMP蛋白具有不少潜在的优越性。比如，基因产物可以局部和耙 向释放，可以最大限度地增加局部治疗效果，减小全身副作用，内源性表 达的蛋白可能具有更大的生物学活性，因此已成为骨修复研究的热点。本 专利技术选择有明确的诱导成骨作用的BMP-2基因与Nell-1协同修饰大鼠 bMSCs作为组织工程化骨的种子细胞构建组织工程化骨，促进颌骨缺损修 复。骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells ， bMSCs)具有来源丰富， 采集方便,容易在体外培养、诱导、扩增的特点，并具有明确的成骨潜能， 是组织工程化骨理想的种子细胞。该细胞在体外培养具有较强的传代增殖 能力，外源目的基因易于导入，因此也是骨缺损基因治疗较为理想的耙细 胞。应用bMSCs来表达基因有许多优点，bMSCs 4艮容易采集并进行组织 培养，其自身具有成骨潜能。本专利技术利用Nell-l与BMP-2基因协同转染大 鼠、狗、兔、羊、猪等bMSCs ，然后将基因修饰的细胞与生物支架材料复 合(如磷酸三钙、多孔羟基磷灰石、珊瑚、藻酸4丐、胶原等)可以构建组织工程化骨。以上海贝奥路生物材料有限公司研制的微孔结构及降解率可控P-磷酸三钙(p-tricalcium phosphate, p-TCP)为例,可以起到临时 支架作用，引导骨生长，允许周围的骨向材料中浸润长入，然后材料被逐 渐吸收，无炎症或排斥反应，不产生局部或全身性毒性反应。TCP是 磷酸三钙不同相结晶物的一种。自二十世纪70年代以来，P-TCP—直是 骨替代材料研究领域的热点之一，其分子式为Ca3(P04)2,工业合成P-TCP 粉料的钙/磷比为1.49-1.51,与正常骨组织的钙磷比接近。P-TCP的 成分与骨基质的无机成分[Ca!。(P04)6(OH)2 ]相似，故被认为具有良好的生 物相容性。P-TCP具有吸收緩慢，低免疫反应和低毒性等特点，并具有 骨引导性，适合作为组织工程修复颌骨的材料。应用Nel卜l与BMP-2基 因协同转染bMSCs作为组织工程化骨的种子细胞与支架材料复合，构建组 织工程化骨修复大鼠临界颌骨缺损。综上，本专利技术用贴壁法对大鼠bMSCs 进行了培养，以Nell-l与BMP-2基因协同转染体外培养的大鼠bMSCs促 进bMSCs成骨分化。本专利技术的技术方案如下 一种Nell-l与BMP-2基因协同修饰bMSCs 构建组织工程化骨，它由下列方法制得:(1 )腺病毒介导的Nell-1与BMP-2 基因协同转染体外培养的骨髓基质细胞；(2)将步骤(1)得到的产物、 生物支架材料复合构建组织工程化骨。腺病毒介导的Nell-l与BMP-2以 MOI=50pfu/cell转染体外培养的骨髓基质细胞，骨髓基质细胞来源鼠、 兔、羊、狗、猪骨髓基质细胞，生物支架材料是磷酸三4丐、多孔羟基磷灰 石、珊瑚、藻酸钓、胶原，生物支架材料是l3-磷酸三钙，细胞密度为5 x 10Vml的细胞悬液与生物支架材料复合。Nell-l与BMP-2协同{务饰bMSCs构建组织工程化骨在颌骨缺损^^复 领域中应用。本专利技术所公开一种双基因协同修饰的组织工程化骨及其应用，其优点 表现在本专利技术把基因治疗与组织工程方法结合起来，以bMSCs作为基因 治疗的靶细胞，同时应用其作为组织工程化骨的种子细胞，通过基因协同 修饰bMSCs后的自分泌和旁分泌作用，加速成骨。组织学结果显示 Nel卜l与BMP-2协同修饰的组织工程化骨修复大鼠临界骨组织缺损时， 新骨形成效果优于Nell-l或BMP-2单独修饰的组织工程化骨附图说明图1: N + B组新骨面积大，骨组织周围可见成骨细胞样细胞分布，出现更多板层骨样组织和骨陷窝样结构(HE染色，放大倍数100)。图2: N + B组新骨面积大，骨组织周围可见成骨细胞样细胞分布，出现更多板层骨样本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双基因协同修饰的组织工程化骨，它由下列方法制得：　（１）腺病毒介导的Ｎｅｌｌ－１与ＢＭＰ－２协同转染体外培养的骨髓基质细胞；　（２）将步骤（１）得到的产物、生物支架材料复合构建组织工程化骨。

【技术特征摘要】
1、一种双基因协同修饰的组织工程化骨，它由下列方法制得(1)腺病毒介导的Nell-1与BMP-2协同转染体外培养的骨髓基质细胞；(2)将步骤(1)得到的产物、生物支架材料复合构建组织工程化骨。2、 根据权利要求1所述的组织工程化骨，其特征在于Nell-l与BMP-2 腺病毒载体工作浓度分别为50pfu/细胞。3、 根据权利要求1所述的组织工程化骨，其特征在于腺病毒介导的 Nell-l与BMP-2以MOI=50pfu/cell转染体外培养的骨髓基质细胞。4、 根据权利要求1所述的组织工程化骨，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋欣泉，张志愿，刘根桃，陈建国，张秀丽，赵君，常庆，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属第九人民医院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]