本发明专利技术公开了一种利用金纳米探针来鉴别小分子化合物作用靶点的分析方法，包括金纳米探针的设计及制备，金纳米探针的表征，金纳米探针的生物活性分析，运用金纳米探针对设定的化合物进行靶点鉴定，靶点蛋白的验证等步骤。本发明专利技术方法可以在进行蛋白质组学分析前，通过金纳米探针的细胞活性检测，先确定连接在金纳米探针表面的化合物是否仍然保持其生物活性，从而优越于传统的亲和层析方法，大大提高了靶点鉴定的效率及其成功率，为研究药物的作用机理提供了新的途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及小分子化合物作用靶点的分析方法，尤其涉及。
技术介绍
亲和层析法是一种常用的靶点鉴定方法。它将待测靶点的小分子化合物连接在一个固体支持物上，通过其与细胞裂解液的孵育、离心、洗涤，分离出靶点蛋白。对这些蛋白进行电泳及质谱分析，可以确定其种类。为了改善靶点鉴定的效率，有各种各样的球珠被尝试用于亲和层析的固体支持物，比如琼脂糖球珠，磁性球珠，橡胶球珠等。然而亲和层析方法最主要的缺点在于，它无法确定待测的小分子在连接到固体支持物上之后是否仍然保持其生物活性。并且以上这些球珠的粒径都在200nm以上，存在不易进入细胞的不足。金纳米材料的研究已经有几十年的历史。现有的研究表明，金纳米较其他纳米材料来说，具有易于合成，易于表面修饰的特点。金纳米颗粒可以通过金硫键与各种含有硫醇基团的小分子化合物相连接。同时，纳米毒理学的研究发现，金纳米颗粒易于被细胞摄取， 且金纳米本身的细胞毒性较小。鉴于以上的特点，有金纳米被尝试用做靶点鉴定探针的报道。但是经权威机构检索，有关用金纳米探针从细胞全蛋白的层次来鉴别小分子化合物作用靶点的研究，目前国内外尚未见报道。
技术实现思路
针对现有靶点分析方法的不足，本专利技术的目的在于提供。本专利技术所述利用金纳米探针来鉴别小分子化合物作用靶点的分析方法，步骤包括(I)金纳米探针的设计及制备选取含有硫醇基团的化合物或经修饰能连接上硫辛酸的化合物，分别以如下方法连接在金纳米颗粒表面①将含有硫醇基团的化合物溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，加入氯金酸水溶液，室温搅拌30士5分钟，之后逐滴加入硼氢化钠水溶液，室温搅拌4士0. 5小时，反应结束后，用盐酸调节PH值至7. 0，离心取沉淀，分别用甲醇和水洗涤沉淀3 5次，之后在50士5°C，真空干燥金纳米颗粒12士3小时，得到连接有所述化合物的金纳米探针；②以如下方法修饰化合物，得到连接上硫辛酸的化合物，然后再连接在金纳米颗粒表面1)在化合物的非活性部位加入一个羟基(5)；2)将二缩三乙二醇(2)的一个羟基用对甲基苯磺酰氯保护，生成二缩三乙二醇单对甲苯磺酸酯(3) 3) 二缩三乙二醇单对甲苯磺酸酯⑶与邻苯二甲酰亚胺钾反应生成相应的2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙基邻苯二甲酰胺⑷；3)2-(2-(2_羟基乙氧基)乙氧基)乙基邻苯二甲酰胺(4)与加入羟基的化合物 (5)发生成醚反应，化合物连接上2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙基邻苯二甲酰胺(6)；4)连接上2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙基邻苯二甲酰胺的化合物(6)与水合胼反应将其上的邻苯二甲酰亚胺基替换成氨基，生成连接有2- (2- (2-氨基乙氧基)乙氧基)乙醇的化合物(7)；5)硫辛酸与连接有2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙醇(7)的化合物发生偶合反应，生成连接上硫辛酸的化合物(8)；反应式如下权利要求1. ，步骤包括 (I)金纳米探针的设计及制备选取含有硫醇基团的化合物或经修饰能连接上硫辛酸的化合物，分别以如下方法连接在金纳米颗粒表面①将含有硫醇基团的化合物溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，加入氯金酸水溶液，室温搅拌30士5分钟，之后逐滴加入硼氢化钠水溶液，室温搅拌4士0. 5小时，反应结束后，用盐酸调节PH值至7. 0，离心取沉淀，分别用甲醇和水洗涤沉淀3 5次，之后在50 士 5°C，真空干燥金纳米颗粒12士3小时，得到连接有所述化合物的金纳米探针；②以如下方法修饰化合物，得到连接上硫辛酸的化合物，然后再连接在金纳米颗粒表1)在化合物的非活性部位加入一个羟基(5)；2)将二缩三乙二醇(2)的一个羟基用对甲基苯磺酰氯保护，生成二缩三乙二醇单对甲苯磺酸酯⑶；3)二缩三乙二醇单对甲苯磺酸酯(3)与邻苯二甲酰亚胺钾反应生成相应的 2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙基邻苯二甲酰胺⑷；3)2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙基邻苯二甲酰胺(4)与加入羟基的化合物(5)发生成醚反应，化合物连接上2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙基邻苯二甲酰胺(6)；4)连接上2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙基邻苯二甲酰胺的化合物(6)与水合胼反应将其上的邻苯二甲酰亚胺基替换成氨基，生成连接有2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基) 乙醇的化合物(7)；5)硫辛酸与连接有2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙醇(7)的化合物发生偶合反应， 生成连接上硫辛酸的化合物(8)；反应式如下2.如权利要求1所述利用金纳米探针来鉴别小分子化合物作用靶点的分析方法，其特征在于步骤(I)所述经修饰能连接上硫辛酸化合物选噻唑烷酮类化合物。3.如权利要求2所述利用金纳米探针来鉴别小分子化合物作用靶点的分析方法，其特征在于所述噻唑烷酮类化合物选2- (4-苯甲基亚氨基)-5- (4- 二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮或2- (2-氯苯基亚氨基)-5- (4- 二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮。4.如权利要求1所述利用金纳米探针来鉴别小分子化合物作用靶点的分析方法，其特征在于步骤(I)所述含有硫醇基团的化合物选硫醇类化合物。5.如权利要求1所述利用金纳米探针来鉴别小分子化合物作用靶点的分析方法， 其特征在于步骤(II)所述粒径范围为2-4nm，化合物在金纳米表面的上载量为0.4 0.5mmol/g06.如权利要求1所述利用金纳米探针来鉴别小分子化合物作用靶点的分析方法，其特征在于步骤(IV)所述设定的化合物选噻唑烷酮类化合物。7.如权利要求6所述利用金纳米探针来鉴别小分子化合物作用靶点的分析方法，其特征在于步骤(IV)所述设定的化合物选2-(4_苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1， 3-噻唑-4-酮或2- (2-氯苯基亚氨基)-5- (4- 二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮。8.如权利要求1所述利用金纳米探针来鉴别小分子化合物作用靶点的分析方法，其特征在于步骤(IV)所述癌细胞为肺癌细胞H460。9.如权利要求1所述利用金纳米探针来鉴别小分子化合物作用靶点的分析方法，其特征在于步骤(IV)所述离心时间为15 20分钟。全文摘要本专利技术公开了，包括金纳米探针的设计及制备，金纳米探针的表征，金纳米探针的生物活性分析，运用金纳米探针对设定的化合物进行靶点鉴定，靶点蛋白的验证等步骤。本专利技术方法可以在进行蛋白质组学分析前，通过金纳米探针的细胞活性检测，先确定连接在金纳米探针表面的化合物是否仍然保持其生物活性，从而优越于传统的亲和层析方法，大大提高了靶点鉴定的效率及其成功率，为研究药物的作用机理提供了新的途径。文档编号G01N33/531GK102221614SQ201110074869公开日2011年10月19日 申请日期2011年3月28日 优先权日2011年3月28日专利技术者刘寅, 张斌, 张秋, 李丽文, 闫兵 申请人:山东大学本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种利用金纳米探针来鉴别小分子化合物作用靶点的分析方法，步骤包括：（Ｉ）金纳米探针的设计及制备选取含有硫醇基团的化合物或经修饰能连接上硫辛酸的化合物，分别以如下方法连接在金纳米颗粒表面：①将含有硫醇基团的化合物溶于二甲基甲酰胺（ＤＭＦ）中，加入氯金酸水溶液，室温搅拌３０±５分钟，之后逐滴加入硼氢化钠水溶液，室温搅拌４±０．５小时，反应结束后，用盐酸调节ｐＨ值至７．０，离心取沉淀，分别用甲醇和水洗涤沉淀３～５次，之后在５０±５℃，真空干燥金纳米颗粒１２±３小时，得到连接有所述化合物的金纳米探针；②以如下方法修饰化合物，得到连接上硫辛酸的化合物，然后再连接在金纳米颗粒表面：１）在化合物的非活性部位加入一个羟基（５）；２）将二缩三乙二醇（２）的一个羟基用对甲基苯磺酰氯保护，生成二缩三乙二醇单对甲苯磺酸酯（３）；３）二缩三乙二醇单对甲苯磺酸酯（３）与邻苯二甲酰亚胺钾反应生成相应的２－（２－（２－羟基乙氧基）乙氧基）乙基邻苯二甲酰胺（４）；３）２－（２－（２－羟基乙氧基）乙氧基）乙基邻苯二甲酰胺（４）与加入羟基的化合物（５）发生成醚反应，化合物连接上２－（２－（２－羟基乙氧基）乙氧基）乙基邻苯二甲酰胺（６）；４）连接上２－（２－（２－羟基乙氧基）乙氧基）乙基邻苯二甲酰胺的化合物（６）与水合肼反应将其上的邻苯二甲酰亚胺基替换成氨基，生成连接有２－（２－（２－氨基乙氧基）乙氧基）乙醇的化合物（７）；５）硫辛酸与连接有２－（２－（２－氨基乙氧基）乙氧基）乙醇（７）的化合物发生偶合反应，生成连接上硫辛酸的化合物（８）；反应式如下：６）将上述连接上硫辛酸的化合物（８）溶于二甲基甲酰胺（ＤＭＦ）中，加入氯金酸水溶液，室温搅拌３０±５分钟，之后逐滴加入硼氢化钠水溶液，室温搅拌４±０．５小时，反应结束后，用盐酸调节ｐＨ值至７．０，离心取沉淀，分别用甲醇和水洗涤沉淀３～５次，之后在５０±５℃，真空干燥金纳米颗粒１２±３小时，得到连接有所述化合物的金纳米探针；（ＩＩ）金纳米探针的表征采用高分辨透射电镜、高效液相色谱－质谱确定制备的金纳米探针的形貌特征，选定形貌为球形，粒径分布在２～５ｎｍ之间，且化合物在金纳米表面的上载量为０．３～０．６ｍｍｏｌ／ｇ的金纳米探针用于靶点鉴定；（ＩＩＩ）金纳米探针的生物活性分析将步骤（ＩＩ）选定的金纳米探针加入培养的处于对数生长期的癌细胞中处理４８～６０小时，以ＷＴＳ－１方法检测细胞脱氢酶的活性，依据金纳米探针对细胞处理前后的检测结果及对细胞生长百分比的分析，判定金纳米探针是否仍保持修饰前的化合物应有的生物活性；（ＩＶ）运用金纳米探针对设定的化合物进行靶点鉴定①常规方式培养癌细胞，然后将癌细胞用细胞裂解液裂解，提取细胞总蛋白，待用；②将步骤（ＩＩＩ）所述保持生物活性的金纳米探针与提取的癌细胞总蛋白在４±０．５℃孵育１～１．５小时；同时将设定的化合物分子与提取的癌细胞总蛋白在４±０．５℃孵育１～１．５小时后，再加入步骤（ＩＩＩ）所述保持生物活性的金纳米探针，继续在４℃孵育１小时；孵育结束后，分别以１５０００±１０００ｒｐｍ离心１０～３０分钟分离金纳米探针，并用ＲＩＰＡ强裂解液和ＳＤＳ上样缓冲液将蛋白从金纳米探针上解离下来，分别收集蛋白溶液进行ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳；③对比未加设定化合物和加入设定化合物的两个样品凝胶电泳结果，从电泳谱图中找出金纳米探针特异性结合蛋白的条带，对其进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析，鉴定出靶点蛋白的种类。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：闫兵，李丽文，刘寅，张秋，张斌，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：88
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