一种液滴阵列PCR芯片及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种液滴阵列PCR芯片，所述芯片是以单晶硅片或玻璃片为基材，采用标准光刻和湿法刻蚀技术制备得到，所述的芯片以单晶硅片或玻璃片为基材、在所述的基材上依次附着SiO2氧化层、由SiO2氧化层表面硅烷化生成的硅烷层，所述的硅烷层布置有光刻胶工艺刻蚀形成的可形成液滴状阵列的亲水坑阵列，所述亲水坑阵列外围设置有封闭成环的护栏，所述的护栏与所述硅烷层液密封连接。并公开了所述芯片应用于实时定量聚合酶链式反应检测或实时定量等温扩增反应检测。本发明专利技术提供的检测系统将反应体积大为降低，而且检测灵敏度和商品化定量PCR仪相当。检测体系简单易操作，成本低，可应用于商业化。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种实时定量PCR芯片及其荧光检测系统，特别是涉及一种基于液滴阵列的PCR芯片和荧光成像检测系统。
技术介绍
实时定量(反转录)聚合酶链式反应(以下简称qPCR或qRT-PCR)技术是以传统 PCR技术为基础建立起来的一种可对原始核酸(包括DNA和RNA)模板拷贝数进行准确定量分析的一种现代分子生物学检测技术。由于qPCR技术具有准确度高，线性范围宽等优势， 因此，已经广泛地用于分子诊断，疾病研究，临床医学等领域。qPCR技术通常遵循传统PCR 的扩增原理，不同的是在每一个循环的退火或延伸阶段进行实时定量检测，而溶液中模板的原始拷贝数的对数与检测阈值(Ct)存在线性关系。在过去的十几年间，传统仪器的微型化和便携化已经成为生物、化学及医药行业的一个重要的发展方向，其中，微型化的传统PCR装置已经成为研究的热点之一，尤其是微型化的qPCR技术由于其具有低成本，高灵敏度和高通量的，有希望成为大规模基因表达分析和药物筛选领域的重要工具平台而逐渐成为研究者关注的焦点。最近，Hua等[Zhishan Hua,卞 Jeremy L. Rouse,卞 Allen Ε.Eckhardt,卞 VijaySrinivasan，卞 Vamsee K. Pamula, Wiley A. Schell, Jonathan L. Benton,J Thomas G. Mitchell, § and Michael G. Pollack, Multiplexed Real-Time Polymerase ChainReaction on a Digital Microfluidic Platform Anal. Chem. 2010，82，2310-2316]提出了一种基于电润湿驱动的数字微流控qPCR 系统，包裹着不同模板分子的液滴在四个平行环形通道中分别经过不同温区，进行扩增和检测。该系统的缺点是通量太低，而且每条环形通道都必须配备一套荧光检测系统，过于复ο国外一些公司也开发了一些微型化PCR产品，例如，STMicroelectronics的 In-Check 系统和美国佳能生命科学的数字多重PCR芯片[I. T.奈特，井上裕司，用于数字多重PCR测定的装置和方法，公开号CN 101583724A，]。两种产品都是基于微流控芯片技术，In-Check 芯片是在进行PCR扩增后，将产物与微阵列芯片进行杂交反应，采用端点检测技术对基因表达进行分析的一种技术。而后者是将芯片得到的PCR产物做溶解度曲线分析，通过荧光强度不同输出O或1信号作为阴性或阳性的阈值，进行SNP分析。另一些公司很早就将研究重点放在了 qPCR技术上，其中，比较典型的例子是美国ABI公司的 Openarray 芯片和Fluidigm的BioMark 微流控数字PCR芯片系统。Openarray 芯片是在不锈钢材料上加工出三千个纳升级孔阵列，并采用化学修饰技术将孔内外表面进行不同处理，以每个纳米孔位基本单位，进行平行qPCR检测分析。该芯片的缺点是加工工艺比较复杂， 成本较高。而BioMark 数字微流控芯片采用的材料是价格便宜的聚二甲基硅氧烷 (PDMS)，采用软刻蚀技术在芯片上加工了几千个微泵阀结构，可以实现自动化添加样品和试剂功能，样品通量最高达到487700。事实上液滴阵列也是一种非常适合进行微型化qPCR分析的技术，美国TTPLabTech公司开发了一套Mosquito :纳升级液滴阵列生成装置，用于高通量蛋白结晶筛选。但是，该系统并没有被用于qPCR系统，可能由于在液滴生成过程中不可避免地会伴随水分蒸发以及PCR热循环过程中极易导致液滴之间相互融合易位等问题。然而，液滴阵列技术无论从成本，芯片设计，还是操作的容易程度等方面都是一种理想的用于微型化 qPCR分析的平台和技术。
技术实现思路
本专利技术提供了一种可实时定量进行PCR检测的反应芯片，以及包括芯片的荧光检测系统。本专利技术采用的技术方案是一种液滴阵列PCR芯片，所述芯片是以单晶硅片或玻璃片为基材，采用标准光刻和湿法刻蚀技术制备得到，所述的芯片以单晶硅片或玻璃片为基材、在所述的基材上依次附着S^2氧化层、由S^2氧化层表面硅烷化生成的硅烷层，所述的硅烷层布置有光刻胶工艺刻蚀形成的可形成液滴状阵列的亲水坑阵列，所述微型亲水阵列外围设置有封闭成环的护栏，所述的护栏与所述硅烷层液密封连接。进一步，所述光刻胶工艺刻蚀形成的微型亲水阵列为按如下步骤得到将单晶硅片或玻璃片在1000-1300°c氧化反应表面生成SiA氧化层，然后使SiA氧化层上硅烷化生成硅烷层，在硅烷层表面甩一层AZ光刻胶，于80-90°C加热坚膜10-20分钟，冷却后，在光胶表面覆盖印有透光阵列点的掩膜，在250 350nm的紫外光下进行光刻，移除掩膜后，将单晶硅片或玻璃片加入0. 5-0. 7% NaOH溶液中显影2 8分钟，再置于刻蚀液中反应10分钟，所述刻蚀液的组成为lmol/L HF、0. 5mol/L朋/和0. 75mol/L HNO3，然后取出单晶硅片或玻璃片，用去离子水清洗，除去表面剩余的AZ光刻胶，即得可形成液滴状阵列的亲水坑阵列。所述芯片优选以单晶硅片为基材。更具体的，本专利技术所述的护栏由环形玻璃制成。本专利技术所述光刻的时间通常为30秒 1分钟。更进一步，本专利技术所述芯片按如下方法制得以单晶硅片或玻璃片为基材，采用标准光刻和湿法刻蚀技术制备得到单晶硅片或玻璃片在1000-1300°C高温炉内氧化反应 2-4小时，表面生成SiO2氧化层，SiA氧化层约1 μ m厚，然后置于1 %的十八烷基三氯硅烷溶于甲苯的溶液中常温反应2-4小时，使S^2氧化层上硅烷化，生成硅烷层，清洗后再在硅烷层表面甩一层AZ光刻胶，于80-90°C加热坚膜10-20分钟，冷却后，在光胶表面覆盖印有透光阵列点的掩膜，在250 350nm的紫外光下进行光刻，移除掩膜后，将单晶硅片或玻璃片加入0. 5-0. 7% NaOH溶液中显影2_8分钟，再置于刻蚀液中反应10分钟，所述刻蚀液的组成为lmol/L HF、0. 5mol/L NH4F和0. 75mol/LHN03，然后取出硅片，用去离子水清洗，除去表面剩余AZ光刻胶，即得可形成液滴状阵列的亲水坑阵列，将一片环形玻璃片用环氧树脂胶粘在芯片表面的阵列区域周围作为护栏，露出阵列区域，制得所述液滴阵列PCR芯片。最优选的，本专利技术所述芯片是以单晶硅片为材料，采用标准光刻和湿法刻蚀技术制备得到单晶硅片在1100°C高温炉内氧化反应2小时，表面生成SiO2氧化层，然后置于的十八烷基三氯硅烷溶于甲苯的溶液中常温反应2小时，使SW2氧化层上硅烷化，生成硅烷层，清洗后再在硅烷层表面甩一层AZ光刻胶，于90°C加热坚膜10分钟，冷却后，在光胶表面覆盖印有透光阵列点的掩膜，在250 350nm的紫外光下进行光刻，移除掩 膜后，将单晶硅片加入0. 7% NaOH溶液中显影2-8分钟，再置于刻蚀液中反应10分钟，所述刻蚀液的组成为lmol/L HF、0. 5mol/L NH/和0. 75mol/L HNO3,然后取出单晶硅片，用去离子水清洗，除去硅片表面剩余AZ光刻胶，即得可形成液滴状阵列的亲水坑阵列，再将一片环形玻璃片用环本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种液滴阵列ＰＣＲ芯片，其特征在于所述芯片是以单晶硅片或玻璃片为基材，采用标准光刻和湿法刻蚀技术制备得到，所述的芯片以单晶硅片或玻璃片为基材、在所述的基材上依次附着ＳｉＯ２氧化层、由ＳｉＯ２氧化层表面硅烷化生成的硅烷层，所述的硅烷层布置有光刻胶工艺刻蚀形成的可形成液滴状阵列的亲水坑阵列，所述亲水坑阵列外围设置有封闭成环的护栏，所述的护栏与所述硅烷层液密封连接。

【技术特征摘要】
1.一种液滴阵列PCR芯片，其特征在于所述芯片是以单晶硅片或玻璃片为基材，采用标准光刻和湿法刻蚀技术制备得到，所述的芯片以单晶硅片或玻璃片为基材、在所述的基材上依次附着SiO2氧化层、由SW2氧化层表面硅烷化生成的硅烷层，所述的硅烷层布置有光刻胶工艺刻蚀形成的可形成液滴状阵列的亲水坑阵列，所述亲水坑阵列外围设置有封闭成环的护栏，所述的护栏与所述硅烷层液密封连接。2.如权利要求1所述的液滴阵列PCR芯片，其特征在于所述光刻胶工艺刻蚀形成的可形成液滴状阵列的亲水坑阵列为按如下步骤得到将单晶硅片或玻璃片在1000-1300°C 氧化反应表面生成SW2氧化层，然后使SiA氧化层上硅烷化生成硅烷层，在硅烷层表面甩一层AZ光刻胶，于80-90°C加热坚膜10-20分钟，冷却后，在光胶表面覆盖印有透光阵列点的掩膜，在250 350nm的紫外光下进行光刻，移除掩膜后，将单晶硅片或玻璃片加入 0. 5-0. 7% NaOH溶液中显影2 8分钟，再置于刻蚀液中反应10分钟，所述刻蚀液的组成为lmol/L HF,0. 5mol/L朋/和0. 75mol/L HNO3,然后取出单晶硅片或玻璃片，用去离子水清洗，除去表面剩余的AZ光刻胶，即得可形成液滴状阵列的亲水坑阵列。3.如权利要求1所述的液滴阵列PCR芯片，其特征在于所述的护栏由环形玻璃制成。4.如权利要求1所述的液滴阵列PCR芯片，其特征在于所述芯片按如下方法制得以单晶硅片或玻璃片为基材，采用标准光刻和湿法刻蚀技术制备得到单晶硅片或玻璃片在 1000-1300°C高温炉内氧化反应2-4小时，表面生成SiO2氧化层，然后置于的十八烷基三氯硅烷溶于甲苯的溶液中常温反应2-4小时，使SiO2氧化层上硅烷化，生成硅烷层，清洗后再在硅烷层表面甩一层AZ光刻胶，于80-90°C加热坚膜10-20分钟，冷却后，在光胶表面覆盖印有透光阵列点的掩膜，在250 350nm的紫外光下进行光刻，移除掩膜后，将单晶硅片或玻璃片加入0. 5-0. 7% NaOH溶液中显影2_8分钟，再置于刻蚀液中反应10分钟，所述刻蚀液的组成为lmol/L HF、0. 5mol/L朋/和0. 75mol/L HNO3,然后取出硅片，用去离子水清洗，除去表面剩余AZ光刻胶，即得可形成液滴状阵列的亲水坑阵列，将一片环形玻璃片用环氧树脂胶粘在芯片表...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚波，方群，张云霞，祝莹，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86