一种毒杀松材线虫的生物制剂及其制备方法和应用技术

一种毒杀松材线虫的生物制剂及其制备方法，由生产菌株经过常规的液体和固体发酵后提取制备，其特征在于该制剂的生产菌株为Ｃａｒｙｏｓｐｏｒａ　　ｃａｌｌｉｃａｒｐａ　　ＺＤ２，ＺＤ２菌株已于２００３年７月２８日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为ＣＧＭＣＣ　　ＮＯ．０９８３。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

Biological preparation for killing pine wood nematode and preparation method and application thereof

Biological preparation and preparation method thereof for killing Bursaphelenchus xylophilus, by producing strain by liquid and solid fermentation after a conventional extraction preparation, which is characterized in that the production of the preparation of Caryospora Callicarpa strain ZD2, ZD2 strain has been preserved in common in July 28, 2003 microbial microbial culture collection center Chinese Management Committee and the preservation number is CGMCC NO.0983.

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种毒杀松材线虫的生物制剂及其制备方法和应用，属生物农药

技术介绍
松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)是一种对松树危害极大的有害生物，被称之为“松树癌症”。主要分布在美国、日本、加拿大、中国等国，为松树的特大毁灭性灾害和重要国际检疫对象。我国自1982年在南京中山陵林区首次发现松材线虫以来，迄今为止已漫延到江苏、安徽、广东、浙江、山东、台湾和香港等10多个省区。对松林资源及生态环境、自然景观造成严重破坏，并对广大适生区的松林构成严重威胁。由于该病巳逼近黄山风景区，为保护黄山奇景，国家与安徽省共同投资建立“黄山松材线虫预防体系工程”。目前国内外对松材线虫尚无有效的药剂及防治方法，目前主要采取的保守控制措施为消播媒介松褐天牛、砍伐并烧毁感病松树、加强检疫，控制进一步传播。因此，研究开发山对松材线虫有效的药剂和方法，已经是我国林业发展中迫在眉睫的问题。
技术实现思路
本专利技术的主要目的就是克服现有技术不足，开发一种毒杀松材线虫的生物制剂，达到有效控制松材线虫危害的目的。本专利技术采用的真菌是Caryospora callicarpa ZD2，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址中国.北京.中关村；保藏日期2003年7月28日；保藏登记入册的编号CGMCC NO.0983。本专利技术是这样完成的，将ZD2菌株通过液体发酵和固体发酵后，从代谢产物中提取对松材线虫具有良好毒杀活性的产物，制备成杀松材线虫生物制剂。本专利技术真菌Caryospora callicarpa ZD2培养方法(以下为重量百分比)液体培养基配方为1-4％大豆；1-5％葡萄糖；1-2％淀粉；0.1-0.5％酵母浸膏；0.2-1％氯化钠；0.02-0.1％磷酸二氢钾；0.02-0.1％硫酸镁；0.1-0.6％碳酸钙，余下为水，pH自然。固体培养基配方为0.2-1％碳酸钙；1-3％大豆粉；0.2-1％硫酸氨；0.5-3％过磷酸钙；小麦麦粒92％-96％。pH自然，水份含量为60％。本专利技术毒杀松材线虫生物制剂的制备方法分为液体发酵和固体发酵两种。液体发酵制备方法1、将ZD2的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，于18-26℃下培养6-12天，获得试管种。2、将试管种接种到250ml三角瓶(每瓶装70ml)液体培养基中，培养基配方为前述液体培养基配方，于20-30℃下摇床培养，转速为200-300rpm，培养时间5-8天。3、将含菌丝的发酵液放入离心管中，3600转离心20分钟，过滤后制备得毒杀松材线虫的生物制剂。固体发酵制备方法1、试管种培养方法与前述液体发酵生产方法1相同；2、采用前述固体培养基配方。将小麦用清水浸泡24小时，捞起滤干水后放入沸水中煮，以煮熟但皮不破为适。再捞起滤干水与辅料混合后装入1000ml的三角瓶中，每瓶装700ml，120℃灭菌30分钟后，接入试管种，于22-26℃培养15-20天，直到菌丝长满。3、将已长满菌丝的麦粒挖出，冻干，用氯仿和甲醇，按1∶1比例配制成溶剂浸提，浸提后浓缩，得总粗提物。将粗提物溶于少量二甲基亚砜(DMSO)，再用一定浓度的吐温-20(Tween-20)溶液溶解，得毒杀松材线虫生物制剂。在该制剂中，二甲基亚砜的终浓度不超过3％，Tween-20的终浓度不超过0.3％。本专利技术产品对松材线虫的药效试验药效试验11、试验用药剂按液体发酵方法制备；以未接种的培养基3600转离心20分钟后过滤作为对照。2、松材线虫制备在100ml三角瓶中放入15g经水浸泡2天的玉米粒，加水10ml，高压灭菌，接入灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。25℃培养4至7天。待菌丝铺满三角瓶后，接种经0.25％次氯酸钠表面消毒的松材线虫，28℃培养15至20天。用无菌水将线虫洗下，制成含量为15条/μl的线虫悬浮液。3、试验方法取直径6cm培养皿，灭菌后加入2ml试验用药剂，然后加入20μl线虫悬浮液(300条)，置25℃培养，定时用解剖镜检查线虫，以针刺生理刺激，无反应则确定为线虫死亡，根据死亡率计算出药效。以未接菌的培养基的浸提液作对照，每处理重复三次。4、试验结果表1液体发酵制剂对松材线虫杀虫效果 结果表明液体发酵制剂对松材线虫有良好的杀虫效果，其12小时平均死亡率达72.1％，最高达79.7％；24小时平均死亡率达94.7％，最高达98.3％，48小时平均药效达95.4％，最高达99.3％。药效试验21、试验用药剂固体培养基配方为1％碳酸钙；3％大豆粉；0.5％硫酸氨；0.5％过磷酸钙；小麦麦粒95％。按前述固体发酵提取杀松材线虫毒素的制备方法制备试验用药剂。对照药剂按前述固体发酵生产方法，但固体培养基中不接入试管种。2、松材线虫制备与药效试验1相同。3、试验方法与药效试验1相同。4、试验结果表2固体发酵制剂对松材线虫杀虫效果 结果表明固体发酵制剂对松材线虫有良好的杀虫效果，12小时和24小时时药效不显著，36小时药效显著，死亡率达86.0％。从液体发酵和固体发酵制剂来看，尽管其药效有所差异，液体发酵药效显著高于固体发酵。但都对松材线虫产生了很好的毒力，显示其潜在的应用开发前景。具体实施例方式实施例一将Caryospora callicarpa ZD2的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，20℃下培养9天，获得试管种。再将试管种接种到250ml三角瓶中(每瓶装70ml)液体培养基中，培养基配方为2％大豆粉；2％葡萄糖；1％淀粉；0.2％酵母浸膏；0.4％氯化钠；0.05％磷酸二氢钾；0.05％硫酸镁；0.2％碳酸钙，余下为水，pH自然；于22℃下摇床培养，转速为250rpm，培养时间7天。再将含菌丝的发酵液放入离心机离心，转速为3600转，时间为20分钟，过滤后得杀松材线虫生物制剂。实施例二试管种培养方法与实施例一相同。将试管种接种到麦粒固体培养基上，培养基配方为1％碳酸钙；3％大豆粉；0.5％硫酸氨；0.5％过磷酸钙；小麦麦粒95；pH自然，水份含量为60％。将小麦麦粒用清水浸泡24小时后，捞起放入煮沸的水中煮，以煮熟皮不破为适，捞起滤水后与辅料混合后装入1000ml的三角瓶中，每瓶装700ml，120℃灭菌30分钟后，接种后置于22℃培养16天。然后将固体培养的菌株挖出，冻干，用氯仿和甲醇，按1∶1比例配制成溶剂浸提，浸提后浓缩，得总粗提物。将粗提物溶于少量二甲亚砜(DMSO)，再用一定浓度的吐温-20(Tween-20)溶液溶解，得杀松材线虫生物制剂乳浊液。在该乳浊液中，二甲亚砜的终浓度不超过3％，Tween-20的终浓度不超过0.3％。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种毒杀松材线虫的生物制剂及其制备方法，由生产菌株经过常规的液体和固体发酵后提取制备，其特征在于该制剂的生产菌株为Caryospora callicarpa ZD2，ZD2菌株已于2003年7月28日保...

【专利技术属性】
技术研发人员：张克勤，赵智娴，董瑾艳，周薇，
申请(专利权)人：云南大学，
类型：发明
国别省市：