一种防治三七根腐病的生物菌剂的制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种防治三七根腐病的生物菌剂的制备方法和应用，属生物农药技术领域。该生产方法的工序包括微生物菌种培养，微生物的大量繁殖及菌剂加工。本发明专利技术使用的微生物是侧孢短芽孢杆菌（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）Ｇ４菌株。该菌株已于２００３年６月２日武汉大学的中国典型培育物保藏中心，保藏号：ＣＣＴＣＣ　　ＮＯ：Ｍ２０３０４５。利用本发明专利技术生产的菌剂对三七根腐病有很好的防治效果。本发明专利技术具有原料成本低，生产工艺先进易行，菌剂质量高、防治效果好等优点。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种防治三七根腐病的生物杀菌剂的制备方法和应用，属微生物农药
技术介绍
三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen，1948)，又名田七、山漆和金不换等，是五加科人参属的一种多年生阴生草本植物，作为第三纪古热带的残遗物种现仅存于北纬23°30′附近的我国云南省文山州和广西自治区百色地区的部分中高海拔地区。由于具有活血化淤、消肿止痛和滋补强身等多种功效，故作为我国中医药中的一种名贵药材而被广泛用于多种疾病特别是近年来日益严重的心血管疾病的预防和治疗。目前，野生三七已十分罕见。大力开展人工栽培和进行大面积集约化种植是解决野生资源日益枯竭问题和不断满足国内外对三七日益增长需求的重要手段。云南省文山州由于具有独特的气候和土壤条件，历史上一直是我国三七的主要产地。由于三七具有的重要经济价值，目前该草药的种植和加工已成为云南省文山州发展地方经济的重要支助产业之一。但由于连年大面积单一种植，加之三七为多年生宿根草本植物，性喜温暖阴湿，因此病害问题十分突出，特别是根腐病问题，目前已成为限制三七种植业发展的严重障碍。据王朝梁等人的调查，各年生三七均可受害，且生长年限越长受害越重，在文山州的发病率一般为5-20％，严重的达46.68％，甚至绝产。对该病的防治目前主要依靠轮作倒茬和化学药剂灌根。但轮作年限一般要求8年以上，生产上难以大面积推行。药剂灌根虽有效，但农药残留问题严重。因此，研究开发高效的生物杀菌剂很有经济价值和社会价值。三七根腐病是由多种病原菌复合侵染或交叉感染引起的。与症状相关的微生物类群主要包括Cylindrocarpon didynum、C.destructans、Fusarium solani、F.oxysporum、Phytophthora cactorum、Phoma herbarum、Rhizoctonia solani和Pseudomonas sp.等。其中两种株孢菌Cylindrocarpon didynum和C.destructans在田间分布范围较广，分离频率较高，可导致典型的黄腐型症状，被认为是生产上三七根腐病的主要致病菌。侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)是一种好氧的，可形成芽孢的细菌。该菌可通过形成伴孢晶体，分泌酶、毒蛋白或其他毒肽而产生杀菌功能。
技术实现思路
本专利技术的目的是通过对一株具有杀菌功能的侧孢短芽孢杆菌研究，开发应用于防治三七根腐病的生物杀菌剂。本专利技术利用Brevibacillus laterosporus G4菌株或由该菌株产生的各种突变株，通过液体培养方法，获得菌体培养物(包括菌体及其代谢物质)，添加农业上允许使用的填充料，粘合剂，表面活性剂等有利于有效成分施用和分散的物质，制成种粉剂，颗粒剂，可湿性粉剂，用于防治引起三七根腐病的主要病原菌Cylindrocarpon didynum和C.destructans。侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)G4菌株已于2003年6月2日保藏于武汉大学中国典型培育物保藏中心，保藏号CCTCC NOM203045。本专利技术通过以下步骤实现(1)本专利技术使用的微生物的来源和特性；(2)微生物菌种的培养(包括微生物试管斜面种子培养、微生物液体种子培养)(3)微生物菌体及其代谢物质的大量培养；(4)菌剂的加工及应用。以上各步骤分述如下本专利技术使用的微生物是侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)G4菌株或由该菌株通过突变、遗传改造获得的衍生物。该菌株已于2003年6月2日保藏于武汉大学中国典型培育物保藏中心，保藏号CCTCC NOM203045。G4菌株形态特征是菌体长杆状，个体较大，两端钝圆，多以凝集形式存在。在YPD培养基(10克酵母浸膏，5克蛋白胨，15克葡萄糖，20克琼脂，水1000毫升，pH6～7)上，菌落呈圆形、隆起、边缘较整齐，表面无光泽、粗糙、类似细小粉末状，菌苔白色；培养36小时后可见大量脱落的芽孢，芽孢为椭圆形呈独木舟状体。G4菌株通过分泌细胞壁降解酶分解病原真菌的细胞壁，继而通过分泌的抗菌肽抑制病原菌的生长和繁殖，其抑菌能力显著高于同类的其它侧孢短芽孢杆菌。微生物斜面种子培养方法将微生物的菌丝体接种到YPD培养基斜面上，28～32℃下培养1～4天，获得试管种。微生物液体种子的培养方法将斜面种子接种到YDFG液体培养基(5克酵母粉，150克大豆饼粉，5克鱼粉，200克葡萄糖，水1000毫升，pH6～7)中，于25～35℃，转速为200～300rpm的摇床上培养2～5天，获得液体菌种。微生物液体条件下的大量繁殖方法将液体种子接种到有液体YDFG培养基的20立升，50立升，1000～4000立升发酵罐中，生产这种微生物的菌体和代谢产物。发酵时，发酵罐的培养温度控制在28～35℃，转速为300～500rmp，培养时间36～72小时。菌剂各种剂型的制备如下粉剂的制备微生物大量菌体制备好以后作为原药与粉碎(粒径小于1毫米以下)的单一或组合的填料(如草粉，米糠，木屑，滑石，叶蜡石，高岭土，膨润土，凹凸棒土，硅藻土，陶土，草炭等)和助剂(如烷基芳基聚氧乙基醚，脂肪醇，氧乙基醚，烷基萘磺酸盐，木质素磺酸盐以及它们的复配物)混合，混合物中微生物及其代谢物(即发酵终产物)的重量百分比为30～75％。混合之后将水分相对湿度调节到5％以下，包装，室温或4～10℃下保存。颗粒剂的制备按粉剂的方法将菌体与填料和助剂混合，用造粒机制成直径为1～4mm，长度为0.5～8cm的颗粒，在30～35℃下烘干到水分含量小于5％，制成颗粒剂。可湿性粉剂的制备微生物大量发酵生产以后，将发酵终产物与填料(同粉剂)，润湿剂(茶枯，皂角，土温60，拉开粉，洗衣粉，十二烷基苯磺酸钠等)，分散剂(No，NNO，PolyFON，SOPA，HO，拉散剂MF等)，稳定剂(如抗坏血酸)均匀混合，将水分调节到2％以下。在制备时先将微生物发酵物以外的成分混合并粉碎小于44微米后再与菌体混合。可湿性粉剂中微生物的重量百分比为35～75％。以上菌剂中，粉剂和可湿性粉剂的使用方法可以是拌种，拌土穴施、沟施，也可以是喷雾；颗粒剂为拌土穴施。以上菌剂的使用时期可以是播种期，一年期和二年期。本专利技术产品对三七根腐病菌的抑制试验试验一 粉剂、可湿性粉剂、颗粒剂防治三七根腐病菌的室内平板测定1.试验菌剂及稀释粉剂、可湿性粉剂、颗粒剂(其中，填料为85％草炭和15％硅藻土；助剂为50％烷基萘磺酸盐和50％木质素磺酸盐；菌剂中微生物发酵终产物的重量百分比为50％)通过上述方法制备；用水将菌剂稀释500倍后备用。以水作为菌剂的对照。2.病原菌的准备柱孢菌C.didynum和C.destructans由专利技术人分离自云南文山州所采集的三七根腐病病根。将这两种病原菌分别接种到PDA培养基(蔗糖20g，去皮马铃薯200g，琼脂10g，用水定容至1000mL)平板上，25℃下培养14天后所得的菌落作为接种体备用。3.试验方法在PDA平板(直径＝9cm)上接种1片病原菌菌落(直径＝5mm)，在与病原菌接种体距离3cm处的牛津杯(1×0.5cm)中加入200μL菌剂稀释液。每处理本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种防治三七根腐病的生物菌剂的制备方法，其生产工序包括微生物试管斜面种子培养和微生物液体种子培养；将液体种子接入液体培养料中，通过液体培养，获得大量的菌体及其代谢物；根据剂型需要将菌体及其代谢物与相应的填充料、粘合剂、表面活性剂混合，制成粉剂、颗粒剂和可湿性粉剂，其特征在于：１．１所用的微生物为侧孢短芽孢杆菌（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）Ｇ４菌株，该菌株已于２００３年６月２日保藏于武汉大学的中国典型培育物保藏中心，保藏号：ＣＣＴＣＣＮＯ ：Ｍ２０３０４５；１．２微生物液体下大量繁殖所用的培养基成分为：５克酵母粉，１５０克大豆饼粉，５克鱼粉，２００克葡萄糖，水１０００毫升，ｐＨ６～７；１．３微生物及其代谢产物在制成的粉剂、可湿性粉剂和颗粒剂中的重量百分比为３０ ％～７５％，菌剂的含水量小于５％。

【技术特征摘要】
1.一种防治三七根腐病的生物菌剂的制备方法，其生产工序包括微生物试管斜面种子培养和微生物液体种子培养；将液体种子接入液体培养料中，通过液体培养，获得大量的菌体及其代谢物；根据剂型需要将菌体及其代谢物与相应的填充料、粘合剂、表面活性剂混合，制成粉剂、颗粒剂和可湿性粉剂，其特征在于1.1所用的微生物为侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)G4菌株，该菌株已于2003年6月2日保藏于武汉大学的中国典型培育物...

【专利技术属性】
技术研发人员：莫明和，张克勤，黄英，周薇，田宝玉，
申请(专利权)人：云南大学，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]