一种甘蔗黑穗病抗性鉴定方法技术

本发明专利技术涉及植物抗病性鉴定技术领域，提出一种甘蔗黑穗病抗性鉴定方法，首先用微量新鲜甘蔗黑粉菌冬孢子分离培养出甘蔗黑粉菌异型交配型（+、-）单倍体担孢子，然后经过菌株扩大培养、接种、发病率调查、抗性评价等步骤，本发明专利技术具有以下突出的实质性特点和显著的进步：1、只需极少量甘蔗黑粉菌冬孢子经分离培养，即可满足接种需要，工作量小；2、异型交配型菌株能够超低温保存，经活化、扩大培养后可作接种源，无需每次鉴定都重新采取菌种并分离培养；3、本发明专利技术抗性鉴定历期短、灵敏性高；4、还可利用本发明专利技术的方法，鉴别出参试品种所抗感的黑穗病生理小种类型，有效指导甘蔗抗黑穗病育种及蔗区品种合理配置。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物抗病性鉴定
，尤其涉及一种甘蔗黑穗病的抗性鉴定方法，还涉及到甘蔗黑粉菌的生理小种的鉴定方法。
技术介绍
由甘蔗黑粉菌(K sciteffiiZ^a)引起的甘蔗黑穗病是一种世界性重要甘蔗病害， 也是我国一种经济危害性最严重的甘蔗病害。防控该病害最经济最有效的方法是抗病育种，抗病育种的基础和关键是抗病性鉴定方法，即通过抗病性鉴定方法筛选出甘蔗黑穗病的高抗品种进行育种。我国现在普遍使用的甘蔗黑穗病抗性鉴定方法是利用人工采集的甘蔗黑粉菌混合冬孢子浸渍蔗芽进行甘蔗黑粉菌的接种，然后根据接种材料的黑穗病株发生率，对比黑穗病抗性分级标准(1 5级分类法)进行抗性分级，筛选出高抗的抗病品系以便于育种。该鉴定方法最大的优点是操作简单，经济实用，存在的问题是1、需要6个月以上，鉴定历期长；2、需采集大量黑粉菌冬孢子作为接种源，工作量大；3、该方法使用的接种源为混合冬孢子，无法鉴别出参试品种抗感甘蔗黑穗病生理小种类型，从而不能有针对性的指导甘蔗抗黑穗病品种选育及蔗区甘蔗品种合理配置，影响了甘蔗抗黑穗病育种效率及病害防控效果。因此，研究建立高效快速且能鉴别甘蔗黑穗病生理小种类型的甘蔗黑穗病抗性鉴定方法非常重用。
技术实现思路
本专利技术目的是针对现有甘蔗黑穗病抗性鉴定存在鉴定历期长、需冬孢子量大、不能鉴别参试品种生理小种类型等不足之处，提出，该方法具有历时短、工作量小、高效快速的特点，还可鉴别参试品种抗感甘蔗黑穗病生理小种类型， 优化甘蔗抗黑穗病的育种，提高甘蔗黑穗病防控效果。本专利技术的目的通过以下技术方案来实现，其特征在于包括以下步骤步骤A、甘蔗黑粉菌异型交配型(+、_)单倍体担孢子的分离培养 Al.在无菌条件下，取3 IOug新鲜甘蔗黑粉菌冬孢子，用YEPS液体培养基充分稀释成50 100个甘蔗黑粉菌冬孢子/mL的稀释液。A2.吸取100 200uL稀释液均勻涂板于YEPS固体培养基上，于观 30°C下培养2 3天，得到白色“羊毛状”单菌落。A3.挑取1个白色“羊毛状”单菌落，用YEPS液体培养基充分稀释成50 100个担孢子/mL的稀释液，然后吸取100 200uL稀释液均勻涂板于YEPS固体培养基上，于观 30°C下培养2 3天，得到“酵母状”单菌落。A4.挑取10 15个“酵母状”单菌量菌液落分别于400 500uL的YEPS液体培养基中混勻，然后于观 30°C下振荡培养1 2天，得到OD6tltl值为1. 0-1. 5的菌液。A5.将A4得到的各个菌液分别吸取1 2uL在YEPS固体培养基上一对一随机配合于^ 30°C下培养2 3天，得到“酵母状”菌落和“羊毛状”菌落，“酵母状”菌落为同型(+、+/-、_)交配型单倍体担孢子所形成，“羊毛状”菌落为异型交配型(+、-)单倍体担孢子形成；由此确定A4中至少一对异型交配型菌液。步骤B、菌株扩大培养取步骤A4中的一对异型交配型单倍体担孢子菌液，分别用YEPS液体培养基3 5mL 于沘 30°C扩大培养1 2天，得到OD6tltl值达1. 0-1. 2的2份菌液； 步骤C、接种将步骤B培养得到的2份菌液等体积混勻；随后用注射器吸取20 30uL混合菌液，注射入事先种植好的甘蔗小苗生长点，接种甘蔗小苗20 30株/品种。步骤D、发病率调查将步骤C接种的甘蔗小苗置于25 30°C下生长，自第1株甘蔗发生黑穗病起，定期调查、记录甘蔗黑穗病发生株数，并将记录过的黑穗病发病株连根挖除，调查历期2 3个月， 并计算每个参试品种的黑穗病株发生率。步骤E、抗性评价根据黑穗病抗性分级标准及参试品种的黑穗病株发生率，评价参试品种的黑穗病抗性水平及所抗感的甘蔗黑粉菌的生理小种。YEPS液体培养基为酵母菌发酵常用培养基，主要成份为酵母粉(yeast)、蛋白胨 (peptone)、蔗糖(sugar)和水，其比例通常为酵母粉10 20g/L、蛋白胨10 20g/L、蔗糖 20 40g/L。关于YEPS培养基有如下报道食品科技2001年第二期中王岁楼等“某些添加物对红酵母生长及类胡萝卜素合成的影响”中所介绍的基础培养基(YEPS)酵母粉1%、蛋白胨1%、蔗糖4%。核技术2003年7月第沈卷第7期第510页中刘静等“利用中子活化分析法研究高生物量富铬酵母的培养条件”中介绍的YEPS培养基酵母粉1%、蛋白胨1%、蔗糖1。中国农业科学2006年第9期第1805页中倪深等“基于PCR技术的艳米丝轴黑粉菌侵染率及扩展进程的研究”所介绍的YEPS培养基酵母粉1%、蛋白胨2%、蔗糖2%、琼脂粉2%) ο西北农业科技大学学报(自然科学板)2007年2月第35卷第2期第174页中菜丽红等“培养基中主要成分对酵母生长及富硒性能的影响”所介绍的发酵培养基(PEYS培养基)酵母粉(YE) 10g/L、蛋白胨(P) 10g/L、蔗糖(S) 40g/L。YEPS固体培养基是在YEPS液体培养基再添加1. 2 2. 0%(m/V)琼脂糖。本专利技术步骤A的目的从甘蔗黑粉菌冬孢子中分离出异型交配型(+、_)单倍体担孢子，这些单倍体担孢子加入20%的甘油后，能在超低温(-80°C)下长期保存，需要时取出活化后经步骤B的扩大培养继续做接种源使用，节约时间和劳力。本专利技术采取的接种方式为注射接种，这种注射接种加快了参试材料黑穗病的发生，一般在1个月内发生黑穗病，3个月内即可完成抗性鉴定，鉴定期短。通过本专利技术的方法在鉴定抗性的同时，还可以根据参试材料黑穗病发生情况推断出参试材料所抗感的黑粉菌生理小种类型，以便有效指导甘蔗抗黑穗病育种及蔗区品种合理配置。本专利技术具有以下突出的实质性特点和显著的进步1、只需极少量甘蔗黑粉菌冬孢子经分离培养，即可满足接种需要，工作量小；2、异型交配型菌液能够超低温(-80°C)保存，经活化、扩大培养后可作接种源，无需每次鉴定都重新采取黑粉菌来分离培养；3、本专利技术抗性鉴定历期短、灵敏性高；4、还可利用本专利技术鉴别出参试品种所抗感的黑穗病生理小种类型，有效指导甘蔗抗黑穗病育种及蔗区品种合理配置。具体实施例方式，按以下步骤进行步骤A、甘蔗黑粉菌异型交配型(+、-)单倍体担孢子的分离培养 Al. 2010年5月采集刚抽出的甘蔗黑穗病单鞭，在超净工作台上，用枪头挑取少量(大约8ug)新鲜甘蔗黑粉菌冬孢子加入到YEPS液体培养基(ImL)中，经充分振荡成悬浮混浊液，再吸取IOOuL混浊液与YEI^s液体培养基(2 mL)充分稀释，得到均勻的稀释液，每毫升稀释液中有50 100个甘蔗黑粉菌冬孢子。A2.吸取IOOuL稀释液均勻涂板于YEPS固体培养基上，于观 30°C下培养2 3天；得到白色“羊毛状”单菌落。A3.挑取其中1个白色“羊毛状”单菌落，用YEPS液体培养基充分稀释成50 100个担孢子/mL的稀释液，吸取200uL稀释液均勻涂板于YEPS固体培养基上，于观 30°C下培养2 3天，得到若干个“酵母状”单菌落。A4.挑取10个“酵母状”单菌落，分别量菌液分别分别于400uL的YEPS液体培养中稀释并混勻，然后于观 30°C下振荡培养1 2天，得到OD6tltl值为1. 2的菌液。A5.将A4得到的各个菌液分别吸取IuL于YEPS固体培养基上进行一对一随机相互交叉配合，于观 30°C下培养2 3本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种甘蔗黑穗病抗性鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：步骤Ａ、甘蔗黑粉菌异型交配型（＋、－）单倍体担孢子的分离培养Ａ１．在无菌条件下，取３～１０ｕｇ新鲜甘蔗黑粉菌冬孢子，用ＹＥＰＳ液体培养基充分稀释成５０～１００个甘蔗黑粉菌冬孢子／ｍＬ的稀释液；Ａ２．吸取１００～２００ｕＬ稀释液均匀涂板于ＹＥＰＳ固体培养基上，于２８～３０℃下培养２～３天，得到白色“羊毛状”单菌落；Ａ３．　挑取１个白色“羊毛状”单菌落，用ＹＥＰＳ液体培养基充分稀释成５０～１００个担孢子／ｍＬ的稀释液，然后吸取１００～２００ｕＬ稀释液均匀涂板于ＹＥＰＳ固体培养基上，于２８～３０℃下培养２～３天，得到“酵母状”单菌落；Ａ４．　挑取１０～１５个“酵母状”单菌量菌液落分别于４００～５００ｕＬ　的ＹＥＰＳ液体培养基中混匀，然后于２８～３０℃下振荡培养１～２天；得到ＯＤ６００值为１．０－１．５的菌液；Ａ５．　将Ａ４得到的各个菌液分别吸取１～２ｕＬ在ＹＥＰＳ固体培养基上一对一随机配合，于２８～３０℃下培养２～３天，得到　“酵母状”　菌落和“羊毛状”菌落，“酵母状”　菌落为同型（＋、＋／－、－）交配型单倍体担孢子所形成，“羊毛状”菌落为异型交配型（＋、－）单倍体担孢子形成；由此确定Ａ４中至少一对异型交配型菌液；步骤Ｂ、菌株扩大培养取步骤Ａ４中的一对异型交配型单倍体担孢子菌液，分别用ＹＥＰＳ液体培养基３～５ｍＬ于２８～３０℃扩大培养１～２天，得到ＯＤ６００值达１．０－１．２的２份菌液；步骤Ｃ、接种将步骤Ｂ培养得到的２份菌液等体积混匀；随后用注射器吸取２０～３０ｕＬ混合菌液，注射入事先种植好的甘蔗小苗生长点，接种甘蔗小苗２０～３０株／品种；步骤Ｄ、发病率调查将步骤Ｃ接种的甘蔗小苗置于２５～３０℃下生长，自出现第１株甘蔗发生黑穗病起，定期调查、记录甘蔗黑穗病发生株数，并将记录过的黑穗病发病株连根挖除，调查历期２～３个月，并计算每个参试品种的黑穗病株发生率；步骤Ｅ、抗性评价根据黑穗病抗性分级标准及参试品种的黑穗病株发生率，评价参试品种的黑穗病抗性水平。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：沈万宽，姜子德，陈健文，习平根，邓海华，刘睿，
申请(专利权)人：广州甘蔗糖业研究所，华南农业大学，
类型：发明
国别省市：81