本发明专利技术涉及微生物工程领域，具体涉及一种利用产油微生物制备生物柴油的方法。本发明专利技术所述方法包括：步骤1、向含有已破壁的产油微生物菌体的发酵液中加入脂肪酶进行水解反应，去除水相，得到油相；步骤2、向油相中加入脂肪酶和短链醇进行酯化反应得到生物柴油。本发明专利技术所述一种利用产油微生物制备生物柴油的方法直接采用含有已破壁的产油微生物菌体的发酵液为原料，以水解、酯化两步反应制备生物柴油，降低了能耗，避免了一步转酯化反应中的可逆反应，提高了生物柴油的转化率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物工程领域，具体涉及。
技术介绍
随着石油资源的日益枯竭和人类环保意识的不断增强，发展清洁可再生能源显得尤为重要。生物柴油是以油料作物、野生油料植物和工程微藻等水生植物油脂以及动物油脂等为原料油，与醇类通过酯交换工艺制成的可代替石化柴油的燃料，是一种对环境友好的可再生能源。与石化柴油相比，生物柴油具有许多明显的优势，其含硫量低，可减少约 30%的二氧化硫和硫化物的排放；其具有较好的润滑性能，可以降低喷油泵、发动机缸体和连杆的磨损，延长其使用寿命；其具有良好的燃烧性能，而且在运输、储存、使用等方面的安全性均好与普通柴油。目前，生物柴油所用原料来源主要有三个方面首先是依靠种植油料植物，如棕榈树、麻风树、油菜等，但是油料植物的油脂产率不高，大力发展生物柴油必然要占用大量耕地，影响粮食生产；其次是依靠动物油脂，然而近两年来世界范围内的农产品价格上涨，导致以动物油脂为原料的生物柴油成本上升；最后是利用餐饮废油、酸化油、地沟油等废弃油脂，但是这些废油中含有许多醛、酮和聚合物等物质，以废油制备生物柴油必然影响其品质，达不到清洁能源的要求。针对上述问题，人们致力于寻找一种新的原料，而产油微生物以种类繁多、分布广、繁殖快、成本低的特点成为生产生物柴油新的油脂资源。产油微生物指产生并储存的油脂占其生物总量的20%以上的酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物，它们能够直接利用阳光、 CO2、氮、磷等简单营养物质快速生长并在胞内合成大量油脂(主要是甘油三酯)，其脂肪酸组成与动植物来源的油脂相似，可以代替动植物油脂制备食用油和生物柴油。现阶段用产油微生物制备生物柴油的方法主要包括碱催化、酸催化法、超临界法以及脂肪酶催化法。用碱催化法生产生物柴油，由于反应中有皂脚形生成，形成絮状沉淀， 使得生物柴油产品不易分离，同时反应过程中生成的皂脚、甘油易与生物柴油、甲醇等乳化，此外反应中易排放废水，形成二次污染。酸催化法因采用大量的酸作为催化剂，使得生物柴油酸值较高，需用水洗涤，这样势必会产生大量废液，加大处理难度，增加环境压力。超临界法制备生物柴油条件苛刻，温度压强过高，对设备要求较高，另外，较高的醇油比造成分离甲醇等短链醇的成本增加。与上述传统化学方法相比，脂肪酶催化法生产生物柴油工艺简单，反应条件温和、 污染小，反应过程中无酸、碱物质不会发生皂化反应，反应时不需要过量的醇，分离、提取简单。如中国专利CN101445741A，公开了“一种微生物柴油的生物合成法”。但是，该方法中采用干燥菌体进行制备生物柴油，增加了能耗，不利于工业生产。同时，该方法的生物柴油转化率不高。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供，使得该方法能够提高生物柴油转化率。本专利技术所述，包括步骤1、向含有已破壁的产油微生物菌体的发酵液中加入脂肪酶进行水解反应，然后去除水相，得到油相；步骤2、向油相中加入脂肪酶和短链醇进行酯化反应得到生物柴油。其中，所述产油微生物优选为小球藻、栅藻、螺旋藻或粘红酵母。本专利技术所述破壁可采用现有常规技术对产油微生物细胞壁破壁，优选为采用细胞壁降解酶破壁，所述细胞壁降解酶可以是一种或多种。其中，藻类微生物以纤维素酶为主，酵母类微生物以多糖水解酶或蛋白酶为主，细菌和霉菌以溶菌酶为主。藻类微生物菌体发酵液的制备方法为取种子液对数期进行接种，接种量为20%， 初始PH值为7. 5，温度27°C，光照40001x，通无菌空气培养8天则达到稳定期；粘红酵母菌体发酵液是在220rpm/min、3(TC下培养种子液18h，然后转入液体培养基中培养5天获得。在现阶段的生物柴油合成中，无论选择何种原料，许多工艺都采用一步转酯化反应来制备，有些工艺还在反应中加入了水。但是，油脂主要是甘油三酯，在一步转酯化的过程中，短链醇置换掉甘油三酯上的甘油(丙三醇)，生成长链脂肪酸酯，即生物柴油，随着反应的进行，甘油越来越多，短链醇越来越少，部分甘油开始重新替换短链醇生成甘油三酯， 出现可逆反应，使转酯化反应不彻底。在有些加水的工艺中，由于脂肪酶在含水较多的情况下会发生水解反应，也会出现可逆反应，进一步影响生物柴油的合成，使生物柴油转化率降低。针对上述问题，本专利技术采用两步法来制备生物柴油。为避免过多的能耗，本专利技术直接采用微生物发酵液作为原料，由于在微生物油脂提取液中含有较多水分，而脂肪酶在水分较多的情况下会发生水解反应，所以本专利技术第一步反应是向微生物油脂提取液中加入脂肪酶进行水解反应，将甘油三酯水解为长链脂肪酸和甘油，然后去除水相获得油相(主要是长链脂肪酸)。因为甘油溶于水，所以甘油不会随油相进入到下步的酯化反应中，避免了由于甘油量过多而导致的可逆反应。在第二步的酯化反应中，本专利技术加入脂肪酶、短链醇将水解反应中得到的长链脂肪酸转化为生物柴油。由于在酯化反应中不存在水分，故脂肪酶不会起水解活性，而是催化短链醇与长链脂肪酸生成对应的长链脂肪酸酯，即生物柴油，从而避免了由于水分的存在引起的可逆反应，提高了生物柴油的转化率。此外，脂肪酶能够在油-水界面下实施催化功能，适当的水分可以使脂肪酶分子的极性和柔性增加，并通过非共价力来维持其催化结构，从而使其活性上升；而过少的水分无法促使脂肪酶发挥其活性；过量的水会使脂肪酶的中心形成水簇，从而导致酶的失活。故本专利技术对发酵液的含水量进行调节，使发酵液含30-70%水分，优选为含50%水分。使得脂肪酶在进行水解反应时能够发挥最大活性。其中，所述水分与步骤1所述脂肪酶的体积质量比为Iml 0. 001-0. 005g，优选为 Iml 0.003g;所述油相与步骤2所述脂肪酶的体积质量比为Iml 0. 002-0. Olg，优选为 Iml 0. 006g ；水解反应时间为10-12h，摇速为160-180rpm/min，温度为30-45°C ；酯化反应时间为8-10h，摇速为180-220rpm/min，温度为30_45°C，所述油相与短链醇的体积比为1 5-15，优选为1 9。本专利技术所述脂肪酶均为市售，酶活为5000U/g。在进行酯化反应时，为避免一次性加入短链醇对脂肪酶活性造成影响，本专利技术分三次加入短链醇，频率为每池加一次，每次加入量为总体积的1/3，所述短链醇优选为甲醇或乙醇。目前国内外利用该反应生产生物柴油的研究很多，但多数研究都是围绕利用植物油和甲醇反应进行的，甲醇对脂肪酶具有很高的毒性，而且在生产中会对工作人员的安全造成很大的威胁。相比较而言，乙醇毒性较小且更加安全，生产出的脂肪酸乙酯不仅可以作为生物柴油，而且在其他领域也有很高的应用价值。长碳链脂肪酸乙酯具有优良的润滑性、 柔软性、铺展性，广泛应用于化妆品、医药、塑料、纺织、皮革、机械切削加工等行业，长碳链脂肪酸乙酯的另一重要应用是用作脂肪酸衍生物中间体。因此，本专利技术更优选为乙醇。由以上技术方案可知，本专利技术所述直接采用含有已破壁的产油微生物菌体的发酵液为原料，以水解、酯化两步反应制备生物柴油， 降低了能耗，避免了一步转酯化反应中的可逆反应，提高了生物柴油的转化率。附图说明图1所示为本专利技术实施例1水解反应所得油相的气相色谱图；其中，1所示为棕榈酸峰，2所示为9，12- 二烯十八酸峰，3所示为油酸峰，4所示为硬脂酸峰，5所示为油酰氯峰；图2所示为本专利技术实施本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种利用产油微生物制备生物柴油的方法，其特征在于，包括：步骤１、向含有已破壁的产油微生物菌体的发酵液中加入脂肪酶进行水解反应，然后去除水相，得到油相；步骤２、向油相中加入脂肪酶和短链醇进行酯化反应得到生物柴油。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张栩，梅斯琳硕，谭天伟，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：11
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