生产有机酸的方法和过程技术

提供了用于有机酸生产的发酵方法，并且包括，提供代谢工程化的突变细菌，其使得ack和pta基因中的一个或两个已经被破坏，通过将该突变细菌固定化同时将该突变细菌暴露于可发酵底物使该突变细菌适应以提高它们对酸的耐受性和提高它们的生长速率，并进一步将适应的突变细菌暴露于可发酵底物足够长的时间，以提供高于约50g/L的最终有机酸发酵产物浓度。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生产有机酸的方法和过程本专利技术总地涉及生产有机酸的方法，更具体地，涉及通过使用源自代谢和过程工 程化的耐酸性厌氧细菌菌株的发酵来生产丁酸、丙酸和醋酸的方法。对矿物燃料将来的缺乏、成本和环境影响的关注激发了开发廉价的、可再生的作 为燃料和化学制品替代来源的生物质的兴趣。因为原油价格上涨，基于生物的化学制品和 工业产品成为有吸引力的石油衍生对应物的替代品。使用厌氧微生物的发酵方法提供了有 前景的将生物质和农业废物转化成化学制品和燃料的途径。存在大量需要适当处置以避免 污染问题的低价值农产品和食品加工副产物/废物。这些生物质废物原料可以用作低价给 料，用于生产燃料和化学制品，如有机酸。因为基于石油原料与日俱增的成本、对石化工业引起的环境污染的公众关注以及 消费者对食品、化妆品和药品中基于生物的天然成分的偏好，从可再生来源生产丁酸和氢 已经成为基于石油加工方法的吸引力日增的替换方案。丁酸是通过梭菌属物种，如酪丁酸 梭菌(C. tyrobutyricum)、丁酸梭菌(C. butyricum)、拜氏梭菌(C. bei jerinckii)、丙酮丁 酸梭菌(C. acetobutyricum)、波氏梭菌(C. populeti)和热醋梭菌(C. thermobutyricum), 从糖产生的短链脂肪酸。尽管丁酸目前主要是通过石化途径来生产的，但对通过发酵从天 然来源生产丁酸存在着日益增加的兴趣。然而，因为产丁酸细菌是异型发酵的并受到丁酸 的强烈抑制，因此用于丁酸生产的常规发酵技术受到反应器生产力低、产物浓度低和产量 低的限制。相似地，常规丙酸发酵方法遇到生产力低、产量低以及终产物浓度低和纯度低的 问题，并且对于商业应用是不经济的。丙酸是广泛用于纤维素塑料、除草剂和香料生产中的 重要化学制品。丙酸也是重要的霉菌抑制剂。它的铵盐、钙盐、钠盐和钾盐广泛用作食品和 饲料防腐剂。目前，大部分商业销售的丙酸是通过石油化学方法生产的。然而，对通过丙酸 细菌从糖的发酵生产丙酸存在着越来越大的兴趣。尽管通过各种方法和菌株改良在提高发 酵生产力和终产物浓度中存在着一些成功，但怎样进一步提高发酵过程中的丙酸产量和纯 度仍然是个挑战。经济上可行的用于化学制品生产的发酵方法的研发需要不仅具有高生产率而且 可以耐受高浓度发酵产物的微生物。改进工业微生物的方法包括经典菌株改良(CSI)的随 机方法和代谢工程化的高度理性方法。尽管CSI是很有效的，但其是时间和资源密集性的。 为了获得对抑制性发酵产物高耐受性的菌株，通常使用通过在递增抑制剂浓度的培养基中 连续培养，并结合通过化学诱变剂或UV照射来诱导突变来连续筛选和选择突变株。然而， 常规培养筛选方法是繁重、费时的，且常常没有结果。最近，也已经应用重组DNA技术来改 善对抑制性产物的细胞耐受性。这些方法通常更有效，但使用也更复杂并需要遗传水平的 详细抑制机理的知识，这对于具有工业发酵关注的大部分微生物而言是不可获得的。代谢工程化广泛用于设计工程化菌株，以通过代谢量分布的改变来获得较高效率 的代谢产物过度产生。迄今为止，大多数代谢工程化工作涉及使用遗传学和生理学得到了 充分研究的微生物(例如，大肠杆菌、酵母和杂交瘤细胞)次生代谢产物(如抗生素)、氨基 酸(例如，赖氨酸)和异源蛋白质的产生。代谢量分布的化学计量分析给代谢工程化、最佳的培养基配方和给料策略以及生物方法优化提供了指导，然而，这些需要对发酵细胞中的 代谢和调控网络的深入了解。尽管理性代谢工程化方法在涉及基因簇内的单个基因或少数 几个基因的情况下已经成功，但在涉及复杂或代谢途径很大程度上未知的许多情况下，是 无效的。这是因为理性代谢工程化方法通常一次针对一个基因，因此不能预测途径中多个 基因间复杂的相互作用。丙酸细菌是革兰氏阳性、过氧化氢酶阳性、不产生孢子、非运动性、兼性厌氧、棒状 的细菌。丙酸细菌属的成员广泛用于维生素B12、四吡咯化合物和丙酸的生产中，已经用于 益生菌和干酪工业中。如附图说明图1中所示，通过丙酸细菌从二羧酸途径生产丙酸，并且通常伴随 醋酸盐和二氧化碳的形成。理论上，通过EMP^mbden-Meyerhof-Parnas)途径进行糖酵解 时，Imol葡萄糖只产生4/3mol丙酸盐和2/3mol醋酸盐。当存在明显的细胞生长和生物质 形成时，试剂的丙酸盐产量要低得多。即使在10g/L相对低的浓度下，丙酸盐也是发酵的强 抑制剂。典型的分批丙酸发酵需要 3天来达到 20g/L丙酸，丙酸产量通常低于0. 4g/g 葡萄糖。就产量、终产物浓度和生产速率而改善丙酸发酵的尝试导致了新的生物方法和突 变菌株的产生，但成功有限。需要发酵方法的显著改进，以使得基于生物的丙酸在经济上与 其石油对应物和其他相关化学制品可相互竞争。酪丁酸梭菌是革兰氏阳性、棒状、产孢子、专性厌氧的细菌，其能够将多种碳水化 合物发酵成丁酸和醋酸。在历史上，由原料奶中存在的梭菌孢子(大部分源自青贮饲料) 的生长引起的干酪中(后期通风)的丁酸发酵可能导致相当大的产物损耗。另一方面，丁 酸在化学、食品和药品工业中具有许多应用。以纯酸的形式来使用，以增强食品风味中类似 黄油的特征。这种酸的酯用作添加剂，用于提高水果香味，以及用作芳香化合物，用于香料 的生产。丁酸是由结肠中膳食纤维的细菌发酵产生的短链脂肪酸之一，并已经显示出具有 抗癌作用，并可以用作营养药物或甚至用作药物来治愈结直肠癌。图2中显示了从糖生产 丁酸的发酵途径。在发酵中还产生了醋酸和氢。几种厌氧细菌可以从多种底物产生丁酸， 作为主要的发酵产物。其中，酪丁酸梭菌具有许多优于其他物种的优点，包括细胞生长的培 养基简单以及相对高的产物纯度和产量。然而，与其他acidogen —样，丁酸细菌受到其酸产物的强烈抑制。因此，常规的丁 酸发酵通常受到反应器生产力低(< 0. 5g/L. h)、产物产量低(< 0. 4g/g)和终产物浓度 低(<30g/L)的限制，使得产物回收困难和生产不经济。许多研究已经针对了提高细胞密 度、反应器生产力和最终的丁酸浓度，但只获得了有限的成功。此外，丁酸不是唯一的发酵 产物。还产生了醋酸作为副产物，其不仅降低了丁酸产量，而且使得终产物回收更困难，变 得更有挑战性。丙酸和丁酸发酵中的一个常见问题是醋酸盐的共同产生，这不仅降低了主要发酵 产物的产量，而且使得产物纯化变得困难。如果通过代谢工程化将底物碳重新分配，从葡萄 糖的丙酸和丁酸产量可以得到很大程度的提高。例如，丙酸发酵途径的化学计量分析表明 通过HMP (磷酸己糖)和/或EMP途径分解代谢的葡萄糖百分比对丙酸盐产生、醋酸盐产生 和三磷酸腺苷(ATP)产生具有意义深远的影响，并且如果通过HMP途径涉及更多葡萄糖，通 常可以产生更多丙酸盐，降低醋酸盐产生。然而，这是以较低的ATP产生为代价的。由于能 量因素，细菌自然将不会采用该途径，但如果阻断丙酮酸盐氧化成醋酸盐，可以强迫其进行该途径。如果HMP途径产生的(X)2可以通过磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧化酶重新引入二羧酸 途径中，丙酸盐产量可以得到进一步的提高。相似地，丁酸发酵中的醋酸盐产生在氧化还原 平衡和ATP产生中起着关键作用，但可以通过将碳流量重新引向丁酸盐产生途径本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于生产有机酸的发酵方法，其包括，提供代谢工程化的突变梭菌或丙酸细菌，其使得ａｃｋ和ｐｔａ基因中的一个或两个已经被破坏，通过将该突变细菌固定化同时将该突变细菌暴露于可发酵底物使该突变细菌适应以提高它们对酸的耐受性和提高它们的生长速率，并进一步将适应的突变细菌暴露于可发酵底物足够长的时间，以提供高于约５０ｇ／Ｌ的最终有机酸发酵产物浓度。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.用于生产有机酸的发酵方法，其包括，提供代谢工程化的突变梭菌或丙酸细菌，其使 得ack和pta基因中的一个或两个已经被破坏，通过将该突变细菌固定化同时将该突变细 菌暴露于可发酵底物使该突变细菌适应以提高它们对酸的耐受性和提高它们的生长速率， 并进一步将适应的突变细菌暴露于可发酵底物足够长的时间，以提供高于约50g/L的最终 有机酸发酵产物浓度。2.如权利要求1中所要求的方法，其中所述突变细菌包括酪丁酸梭菌 (C. tyrobutyricum) PAK-Em,而所述有机酸发酵产物包括丁酸和氢。3.如权利要求2中所要求的方法，其中所述可发酵底物包括糖。4.如权利要求3中所要求的方法，其中所述糖选自葡萄糖、果糖、木糖、乳糖、麦芽糖、 蔗糖及其混合物。5.如权利要求1中所要求的方法，其中所述突变细菌包括酪丁酸梭菌PPTA-Em，而所述 有机酸发酵产物包括丁酸和氢。6.如权利要求5中所要求的方法，其中所述可发酵底物包括糖。7.如权利要求6中所要求的方法，其中所述糖选自葡萄糖、果糖、木糖、乳糖、麦芽糖、 蔗糖及其混合物。8.如权利要求1中所要求的方法，其中所述突变细菌包括酪丁酸梭菌HydEm，而所述有 机酸发酵产物包括丁酸和氢。9.如权利要求8中所要求的方法，其中所述可发酵底物包括糖。10.如权利要求9中所要求的方法，其中所述糖选自葡萄糖、果糖、木糖、乳糖、麦芽糖、 蔗糖及其混合物。11.如权利要求1中所要求的方法，其中所述突变细菌包括产丙酸丙酸杆菌 (P. acidipropioniciMCK-Tet，而所述有机酸发酵产物包括丙酸。12.如权利要求11中所要求的方法，其中所述可发酵底物包括糖。13.如权利要求11中所要求的方法，其中所述可发酵底物包括选自乳酸盐和甘油的碳源。14.如权利要求1中所要求的方法，其中所述突变细菌包括产丙酸丙酸杆菌 TAT-ACK-Tet，而所述有机酸发酵产物包括丙酸。15.如权利要求14中所要求的方法，其中所述可发酵底物包括糖。16.如权利要求14中所要求的方法，其中所述可发酵底物包括选自乳酸盐和甘油的碳源。17.用于生产有机酸的发酵方法，其包括，提供代谢工程化的选自酪丁酸梭菌 (C. tyrobutyricum)、丁酸梭菌(C. butyricum)、拜氏梭菌(C. bei jerinckii)、丙酮丁酸梭 菌(C. acetobutyricum)、波氏梭菌(C. populeti)、热醋梭菌(C. thermobutyricum)和产丙 酸丙酸杆菌(P. acidipropionici)的突变细菌，该细菌使得ack和pta基因中的一个或两 个已经被破坏，通过将该突变细菌在纤维床反应器中固定化同时将该突变细...

【专利技术属性】
技术研发人员：ST·杨，
申请(专利权)人：俄亥俄州立大学，
类型：发明
国别省市：US