桉树有机酸种类和含量的检测方法技术

桉树有机酸种类和含量的检测方法，包括以下步骤：准备桉树试验材料；根据检测内容确定淋洗液梯度程序，制备有机酸混合标准溶液，拟合有机酸浓度和图谱峰面积的线性回归方程，检测实验室及进样器环境保持恒温；提取样品有机酸，去除样液杂质、色素、阳离子的干扰，并设计相应的浓缩倍数；采用自动进样器进样，记录峰面积，根据有机酸混合溶液标准曲线，计算得到样品有机酸的种类和含量。本发明专利技术的检测方法，能显著分开干扰离子，对色谱柱损耗小，检测速度快，灵敏度高，准确性强，重复性好，适用于检测植物各部位的低分子有机酸定性、定量检测。

【技术实现步骤摘要】
桉树有机酸种类和含量的检测方法
本专利技术涉及本专利技术涉及一种检测低分子量有机酸方法，特别是一种桉树有机酸种类和含量的检测方法。
技术介绍
植物根系分泌的有机酸可以降低根际土壤的pH值，同时可与铝、铁、钙等金属元素形成螯合物，提高根际土壤养分的有效性，从而促进植物生长。而植物组织中的有机酸具有调节植物细胞新陈代谢、固定植物养分、参加光合作用和呼吸作用，还可以作为代谢活性溶质，调节渗透压，平衡过多的阳离子。桉树是我国热带亚热带地区极为重要的速生用材树种，其所生长的南方土壤属于富铝化酸性土壤的酸化程度，极易产生活性铝的积累，对植物的生长产生抑制作用。有研究表明，植株体内及其分泌物有机酸与铝离子形成的毒性较低的铝-有机酸螯合物,可有效地降低生长介质中离子态铝的活性,减少了活性铝离子对植株的毒害，目前在大豆、小麦、玉米等农作物上开展了较多的研究，而在林木方面上的研究较少，对桉树有机酸的鉴定未见报道。建立一种简便、快速和高效测定桉树植株及根分泌有机酸含量的新方法，对研究林地地力衰退问题及进一步探索富铝化酸性土壤人工林对铝毒害缓解的作用具有重要意义。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供一种桉树有机酸种类和含量的检测方法，以ICS为核心技术，对以往氯离子干扰部分常见有机酸的测定进行了优化，建立一种能同时检测多种低分子有机酸的方法，方法简便、快速，检测效果好。本专利技术通过以下技术方案达到上述目的：一种桉树有机酸种类和含量的检测方法，包括以下步骤：(1)离子色谱仪(ICS-5000，USA)的测定条件：分析柱AS11-HC(4×250mm)及保护柱AG11-HC(4×50mm)，流动相为KOH梯度淋洗液，ASRS_4mm型抑制器再生模式，CD电导检测器，EG-30淋洗液发生器，柱温35℃，进样量25μL；(2)制作标准曲线：配制乙酸、甲酸、苹果酸、酒石酸、草酸、柠檬酸、顺乌头酸的混合标准溶液，药品均为Aladdin色谱纯级别产品，通过对有机酸浓度和进行线性回归，得到相关线性方程；以有机酸浓度和ICA图谱峰面积定量，建立标准曲线；(3)供试材料准备：以2个月生巨尾桉广林9号，尾叶桉4号为试验材料，用0.1％多菌灵消毒根系20min后，采用水培法收集根系分泌的有机酸；(4)根系分泌的有机酸的收集：不同时间段处理实验结束后，立即将处理植株提起至根系不滴水为止，时间为30～50s，收集含有机酸分泌物的处理溶液；(5)根系分泌的有机酸的纯化：首先将处理溶液经过混合素纤维膜减压过滤收集滤液50ml，滤液经过内部填充8mlH+型阳离子交换树脂AmberliteIR-120B，USA的阳离子交换柱l5mm×11cm，去掉收集液中的阳离子，收集液承接于浓缩瓶中，于旋转蒸发仪R215，Switzerland在40℃水浴中减压旋转浓缩蒸发至干燥，残留物用超纯水溶解后用0.45μm的微孔滤膜后用ICS-5000测定；(6)根系、叶片有机酸的收集植物组织提取有机酸根系0-3cm称取0.2g，叶片称取0.5g，置于预冷研钵中，加入2ml超纯水和少许石英砂，冰浴环境研磨成匀浆，移入10ml离心管中以1ml超纯水分3次洗涤研钵并转入离心管，总体积为5ml；(7)根系、叶片有机酸的纯化在4℃下以5000r/min离心30min，上清液首先经过内部填充2mlH+型阳离子交换树脂AmberliteIR-120B，USA的阳离子交换柱l5mm×11cm去掉收集液中的阳离子，再经过戴安预处理小柱RP，USA吸附植物色素过0.45μm的微孔滤膜后用ICS-5000测定；(8)低分子量有机酸的检测采用自动进样器进样，按色谱条件进样测定，记录峰面积，计算得到有机酸的种类和含量。本专利技术的方法具有操作简便，检测速度快，灵敏度高，准确性强，重复性好，适用于桉树根、叶器官及根系分泌的乙酸、甲酸、苹果酸、酒石酸、草酸、柠檬酸、顺乌头酸等低分子量有机酸的检测。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的技术方案进一步说明。实施例11.七种混合低分子量有机酸标准溶液配制及标准曲线绘制方法(1)分别准确称量200、400、800mg的乙酸、甲酸、苹果酸、酒石酸、草酸、柠檬酸、顺乌头酸，用5mL的1mol·L-1色谱纯级氢氧化钠溶解以上混合物于烧杯中，而后用溶解液定容至100mL，最终配制成有机酸浓度梯度分别为2、4、8μg·mL-1的混合标准溶液。(2)采用离子色谱谱仪ICS-5000进行测定，测定条件：分析柱AS11-HC(4×250mm)及保护柱AG11-HC(4×50mm)，流动相：KOH梯度淋洗液见表1，ASRS_4mm型抑制器再生模式，CD电导检测器，EG-30淋洗液发生器，柱温35℃，进样量25μL，以峰面积定量。采用梯度洗脱方法。表1淋洗液梯度程序(3)将乙酸、甲酸、苹果酸、酒石酸、草酸、柠檬酸、顺乌头酸7种有机酸混合标样进行离子色谱分析，通过对有机酸浓度和图谱峰面积进行线性回归，得到相关线性方程，二者线性关系良好。见表2。表2七种有机酸色谱峰面积与混合标样浓度的线性回归方程有机酸种类线性方程拟合度乙酸y＝0.0342x+0.0190.9995甲酸y＝0.0382x+0.00090.9998苹果酸y＝0.0653x+0.00860.9999酒石酸y＝0.0199x+0.02550.9981草酸y＝0.2304x+0.05950.9999柠檬酸y＝0.0536x+0.01710.9999顺乌头酸y＝0.0053x+0.00170.99362.试验材料处理(1)以2个月生巨尾桉广林9号(Eucalyptusgrandis×E.urophyllaNo.9)无性系组培苗为试验材料，用Hoagland营养液预培养20天，每周用0.1％多菌灵消毒一次，通气量为50L/h。培养液含101.1mg/LKNO3、164.2mg/LCa(NO3)2、48.2mg/LMgSO4、23.0mg/LNH4H2PO4、3.7mg/LFe-EDTA、1.24mg/LH3BO3、0.60mg/LMnCl2、0.32mg/LZnSO4、0.08mg/LCuSO4、0.47mg/L(NH4)6Mo7O24，每3天更换1次培养液。共有3个重复，每个重复10株。(2)20天后从培养液中取出，用0.1％多菌灵消毒20分钟和用自来水清洗3次后，放到盛有自来水的水桶中，培养24小时后测定桉树叶片有机酸含量。5.桉树叶片有机酸收集、纯化(1)取叶片0.5g，置于预冷研钵中，加入2ml超纯水和少许石英砂，冰浴环境研磨成匀浆，移入10ml离心管中以1ml超纯水分3次洗涤研钵并转入离心管，总体积为5ml。(2)在4℃下以5000r/min离心30min，上清液首先经过内部填充2mlH+型阳离子交换树脂AmberliteIR-120B，USA的阳离子交换柱l5mm×11cm去掉收集液中的阳离子，再经过戴安预处理小柱RP，USA吸附植物色素过0.45μm的微孔滤膜后进行ICS测定。5.巨尾桉广林9号叶片低分子量有机酸的测定由表3的测定结果可知，本法建立的检测桉树有机酸种类和含量的方法重复性好，适用于开展上述有机酸的检测和研究工作。表324h时巨尾桉广林9号水培条件下叶片分泌有机酸含量单位：mg/g实施例21.以2个月生巨尾本文档来自技高网...

【技术保护点】
桉树有机酸种类和含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)离子色谱仪(ICS‑5000，USA)的测定条件：分析柱AS11‑HC(4×250mm)及保护柱AG11‑HC(4×50mm)，流动相为KOH梯度淋洗液，ASRS_4mm型抑制器再生模式，CD电导检测器，EG‑30淋洗液发生器，柱温35℃，进样量25μL；(2)制作标准曲线：配制乙酸、甲酸、苹果酸、酒石酸、草酸、柠檬酸、顺乌头酸的混合标准溶液，药品均为Aladdin色谱纯级别产品，通过对有机酸浓度和进行线性回归，得到相关线性方程；以有机酸浓度和ICA图谱峰面积定量，建立标准曲线；(3)供试材料准备：以2个月生巨尾桉广林9号，尾叶桉4号为试验材料，用0.1％多菌灵消毒根系20min后，采用水培法收集根系分泌的有机酸；(4)根系分泌的有机酸的收集：不同时间段处理实验结束后，立即将处理植株提起至根系不滴水为止，时间为30～50s，收集含有机酸分泌物的处理溶液；(5)根系分泌的有机酸的纯化：首先将处理溶液经过混合素纤维膜减压过滤收集滤液50ml，滤液经过内部填充8mlH+型阳离子交换树脂Amberlite IR‑120B，USA的阳离子交换柱l5mm×11cm，去掉收集液中的阳离子，收集液承接于浓缩瓶中，于旋转蒸发仪R215，Switzerland在40℃水浴中减压旋转浓缩蒸发至干燥，残留物用超纯水溶解后用0.45μm的微孔滤膜后用ICS‑5000测定；(6)根系、叶片有机酸的收集植物组织提取有机酸根系0‑3cm称取0.2g，叶片称取0.5g，置于预冷研钵中，加入2ml超纯水和少许石英砂，冰浴环境研磨成匀浆，移入10ml离心管中以1ml超纯水分3次洗涤研钵并转入离心管，总体积为5ml；(7)根系、叶片有机酸的纯化在4℃下以5000r/min离心30min，上清液首先经过内部填充2mlH+型阳离子交换树脂Amberlite IR‑120B，USA的阳离子交换柱l5mm×11cm去掉收集液中的阳离子，再经过戴安预处理小柱RP，USA吸附植物色素过0.45μm的微孔滤膜后用ICS‑5000测定；(8)低分子量有机酸的检测采用自动进样器进样，按色谱条件进样测定，记录峰面积，计算得到有机酸的种类和含量。...

【技术特征摘要】
1.桉树有机酸种类和含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)离子色谱仪ICS-5000，USA的测定条件：分析柱AS11-HC4×250mm及保护柱AG11-HC4×50mm，流动相为KOH梯度淋洗液，梯度洗脱程序为：梯度洗脱时间在0、15、20、21、25min时，KOH溶液的浓度分别为15、60、60、15、15mM，ASRS_4mm型抑制器再生模式，CD电导检测器，EG-30淋洗液发生器，柱温35℃，进样量25μL；(2)制作标准曲线：配制乙酸、甲酸、苹果酸、酒石酸、草酸、柠檬酸、顺乌头酸的混合标准溶液，药品均为Aladdin色谱纯级别产品，通过对有机酸浓度和进行线性回归，得到相关线性方程；以有机酸浓度和ICA图谱峰面积定量，建立标准曲线；(3)供试材料准备：以2个月生巨尾桉广林9号，尾叶桉4号为试验材料，用0.1％多菌灵消毒根系20min后，采用水培法收集根系分泌的有机酸；(1)供试材料的准备：①以2个月生巨尾桉广林9号Eucalyptusgrandis×E.urophyllaNo.9无性系组培苗为试验材料，用Hoagland营养液预培养20天，每周用0.1％多菌灵消毒一次，通气量为50L/h，培养液含101.1mg/LKNO3、164.2mg/LCa(NO3)2、48.2mg/LMgSO4、23.0mg/LNH4H2PO4、3.7mg/LFe-EDTA、1.24mg/LH3BO3、0.60mg/LMnCl2、0.32mg/LZnSO4、0.08mg/LCuSO4、0.47mg/L(NH4)6Mo7O24，每3天更换1次培养液，②20天后从培养液中取出，用0.1％多菌灵消毒20分钟和用自来水清洗3次后，放到盛有自来水的水桶中，培养24小时后测定桉树叶...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨梅，戴勤，叶绍明，谭玲，蒋维昕，赵毅辉，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西;45