一种泛素连接酶及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种泛素连接酶及其应用，所述泛素连接酶为如下所述的蛋白：由ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２所示的氨基酸序列组成的蛋白；或在ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２所示的氨基酸序列中经过取代、缺失和／或添加一个或几个氨基酸且与ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２所示的氨基酸序列具有相同泛素连接酶活性的蛋白。本发明专利技术还提供了制备所述泛素连接酶的方法，还提供了编码所述的泛素连接酶蛋白的氨基酸序列的多核苷酸、包含所述多核苷酸的基因工程载体、宿主细胞，还提供了与所述泛素连接酶特应性结合的抗体，还提供了所述泛素连接酶、所述多核苷酸、所述载体以及所述抗体的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是关于一种新的泛素连接酶及其应用，本专利技术还涉及该泛素连接酶的制备方法，还涉及该泛素连接酶的编码基因及含有该基因的载体、宿主细胞，该泛素连接酶的抗体，以及它们的应用。
技术介绍
内质网相关的蛋白降解过程(ER associated degradation，ERAD)是细胞内重要的质量控制过程，对细胞内稳态的维持非常重要。在此过程中，内质网中的一些分子伴侣首先识别错误折叠的蛋白或者其它需要降解的蛋白，然后在泛素-蛋白酶体的参与下完成这种蛋白的降解。泛素-蛋白酶体是真核细胞靶向性降解正常、错误折叠胞浆或膜蛋白的主要途径。泛素-蛋白酶体系统包括泛素(Ub)、泛素活化酶(E1)、泛素结合酶(E2)、泛素连接酶(E3)、26S蛋白酶体和泛素解离酶(DUB)。蛋白酶体具有精确降解细胞内各种目的靶蛋白的功能，进而参与基因转录和细胞周期调节，以及受体胞吞、抗原提呈、细胞防御和信号转导等各种细胞生理过程。因此泛素-蛋白酶体也在治疗疾病特别是癌症和神经系统退行性疾病中发挥重要作用。例如，一种泛素-蛋白酶体抑制剂万珂(硼替佐米)已被用于多发性骨髓瘤的治疗。2004年诺贝尔化学奖授予了三位科学家，以表彰他们发现了蛋白质泛素化引起的细胞蛋白质降解。蛋白质的泛素化过程是一个依赖ATP的酶促反应：首先在E1的催化下，泛素C末端甘氨酸残基与E1的半胱氨酸残基间形成高能硫酯键而获得活性；E1-泛素结合的中间体再将泛素转移给E2，形成E2-泛素中间体；最后靶蛋白的泛素化还需要另一个特异的泛素蛋白连接酶E3。E3可以直接或间接与底物结合，促使泛素从与E2形成的硫酯中间产物转移到靶蛋白赖氨酸残基的ε氨基基团上，形成异肽键。当第一个泛素分子连接到靶蛋白上后，另外一些泛素分子在E3的催化下相继与底物相连的泛素分子的第48位赖氨酸残基相连，形成一条多聚泛素链，作为底物被蛋白酶体识别和降解的靶向性信号。完成泛素化的蛋白质结构被展平进入26S蛋白酶体，在20S催化中心中被降解，泛素分子可被DUBs从底物上水解下来而被重复利用。因为泛素-蛋白酶体对蛋白质的选择性降解是通过泛素连接酶来实现的，所以泛素连接酶就在这个过程中起到最为关键性的作用。泛素连接酶从结构域上主要分为三类，其中一种类型是含RING finger(指环)结构域的蛋白质。RING finger结构域是由40到60个氨基酸组成的一种锌指结构，能够结合两个锌原子，这个结构域可能参与蛋白与蛋白之间的相互作用，其基本组成是：CX2CX(9-39)C(1-3)HX(2-3)C/HX2C(4-48)CX2C，其中C是半胱氨酸，H是组氨酸，X代表任意氨基酸，括号中的数字代表任意氨基酸的个数。RING finger结构域最基本的组成是其中的几个最为保守的半胱氨酸和组氨酸，根据这些保守的氨基酸，这个结构域可以分为两种：C3HC4和C3H2C3，后面的这种通常被命名为RING-H2型。含有RING finger结构域的分子参与到各种生命活动中。RING finger结构域的发现为了解泛素-蛋白酶体这个降解途径提-->供了更广泛的思路，且部分RING蛋白质还是潜在的靶点，有可能为治疗疾病提供帮助。然而，是不是所有的RING蛋白质均同泛素-蛋白酶体相关，并没有得到验证或证实，对于这方面的验证还需要进行更进一步的大量实验研究。另外，凋亡是所有多细胞生物的一个最基本的生理过程，是细胞的一种主动死亡行为，以维持机体细胞增殖和细胞死亡的平衡。它对于植物和动物的发育、昆虫和两栖类动物的变形、胚胎生长及器官的形态发生、组织的自稳、老化及感染和坏死细胞的清除等方面具有非常重要的意义。根据凋亡信号的来源可以将细胞凋亡信号转导通路分成两条：外源性通路(死亡受体通路)和内源性通路(线粒体通路)。两条信号通路汇集于下游的效应Caspase。效应Caspase在细胞凋亡的执行阶段能够直接引起重要蛋白质的降解和染色体DNA的断裂并最终导致细胞凋亡。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种新的泛素连接酶。本专利技术的另一目的在于提供一种分离的多核苷酸，其编码本专利技术所述的泛素连接酶蛋白的氨基酸序列。本专利技术的另一目的在于提供一种基因工程载体，其包含本专利技术所述的多核苷酸。本专利技术的另一目的在于提供一种经所述的基因工程载体转化、转染或转导得到的宿主细胞。本专利技术的另一目的在于提供一种与本专利技术所述泛素连接酶特应性结合的抗体。本专利技术的另一目的在于提供一种制备所述泛素连接酶的方法。本专利技术的另一目的在于提供所述泛素连接酶、所述多核苷酸、所述载体、所述抗体的应用。本专利技术的另一目的在于提供一种用于诊断肿瘤、治疗肿瘤、抑制肿瘤细胞增殖和/或诱导肿瘤细胞凋亡的药物组合物。一方面，本专利技术提供了一种泛素连接酶，该泛素连接酶为如下a)或b)所述的蛋白：a)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白；或b)在a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与a)限定的氨基酸序列具有相同泛素连接酶活性的由a)衍生的蛋白。另一方面，本专利技术还提供了一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码如上述a)或b)所述的蛋白；所述的多核苷酸优选为具有以下核苷酸序列：a)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；或b)在严格条件下与a)限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；或c)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少90％同源性、且编码与由SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白具有相同泛素连接酶活性的蛋白的核苷酸序列。另一方面，本专利技术还提供了一种基因工程载体，其包含如上所述的多核苷酸；所述的载体优选选自细菌质粒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒和慢病毒。另一方面，本专利技术还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞经所述的基因工程载体转化、转染或转导得到；所述的宿主细胞优选选自大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞和哺乳动物细-->胞。另一方面，本专利技术还提供了一种抗体，其与由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白或其保守变异多肽或片段特异性结合；所述抗体优选为单克隆抗体或多克隆抗体。另一方面，本专利技术还提供了一种制备所述泛素连接酶的方法，该方法包括：在适于表达的条件下，培养含有所述多核苷酸的宿主细胞；所述的宿主细胞优选为上述的宿主细胞；从所述细胞培养物中获得多核苷酸编码的蛋白，制备得到泛素连接酶。另一方面，本专利技术还提供了如下a)或b)所述的蛋白作为泛素连接酶的应用：a)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白；或b)在a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与a)限定的氨基酸序列具有相同泛素连接酶活性的由a)衍生的蛋白。另一方面，本专利技术还提供了所述的泛素连接酶、所述的多核苷酸、所述的基因工程载体、或所述的宿主细胞在制备用于抑制ERK磷酸化的制剂中的应用。另一方面，本专利技术还提供了所述的泛素连接酶、所述的多核苷酸、所述的基因工程载体、所述的宿主细胞、或所述的抗体在制备用于肿瘤的诊断、基因治疗和/或疗效评价的药物组合物中的应用；优选所述的药物组合物为用于治疗肿瘤和/或抑制肿瘤细胞增殖和/或诱导肿瘤细胞凋亡的药物组合物；优选所述的肿瘤为未分化甲状腺癌、胃癌、直肠癌、食道癌或肺癌肿瘤。另一方面，本专利技术还提供了一种用于诊断肿瘤、治疗肿本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种泛素连接酶，该泛素连接酶为如下ａ）或ｂ）所述的蛋白：ａ）由ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２所示的氨基酸序列组成的蛋白；或ｂ）在ａ）限定的氨基酸序列中经过取代、缺失和／或添加一个或几个氨基酸且与ａ）限定的氨基酸序列具有相同泛素连接酶活性的由ａ）衍生的蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种泛素连接酶，该泛素连接酶为如下a)或b)所述的蛋白：a)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白；或b)在a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与a)限定的氨基酸序列具有相同泛素连接酶活性的由a)衍生的蛋白。2.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求1中a)或b)所述的蛋白；所述的多核苷酸优选为具有以下核苷酸序列：a)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；b)在严格条件下与a)限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；或c)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少90％同源性、且编码与由SEQID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白具有相同泛素连接酶活性的蛋白的核苷酸序列。3.一种基因工程载体，其包含如权利要求2所述的多核苷酸；所述的载体优选选自细菌质粒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒和慢病毒。4.一种宿主细胞，该宿主细胞经权利要求3所述的基因工程载体转化、转染或转导得到；所述的宿主细胞优选选自大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞。5.一种抗体，其与由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白或其保守变异多肽或片段特异性结合；所述的抗体优选为单克隆抗体或多克隆抗体。6.一种制备权利要求1所述泛素连接酶的方法，该方法包...

【专利技术属性】
技术研发人员：石太平，彭智，邓唯唯，李娜，郭帅，马大龙，
申请(专利权)人：北京诺赛基因组研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]