一种用于直接肌肉注射治疗糖尿病的人胰岛素前体基因和含有该基因的质粒制造技术

本发明专利技术提供了一种用于直接肌肉注射治疗糖尿病的人胰岛素前体基因，它依次由编码信号肽，Ｂ链，Ｃ链，和Ａ链的核苷酸序列组成。本发明专利技术还提供了含有本发明专利技术的基因并能够在人肌肉组织中表达该基因的质粒。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及将胰岛素前体基因的真核表达质粒直接导入骨骼肌细胞对糖尿病进行基因治疗的技术。基因治疗是近十年来随着现代医学与分子生物学相结合而诞生的，它是指通过基因的转移，将目的基因导入到患者体内，使之弥补原有基因的突变或表达缺陷，达到治疗的目的。目的基因是指弥补功能缺损的外源性正常基因。基因转移途径可分两类一类是目的基因直接注射，即将带有目的基因的病毒、包裹有目的基因的脂质体或裸露的目的基因直接注射到试验个体内；另一类是将细胞系或试验对象的细胞取出，体外培养，并用病毒、脂质体等方式导入目的基因，而后将这些遗传修饰的细胞重新输回试验个体体内。目的基因直接转移途径操作简便，容易推广，但是这类方法目前尚未成熟，存在疗效短、免疫排斥及安全性等问题。细胞转移方法比较经典，而且效果较易控制，但其存在步骤多，技术复杂难度大，不容易实施的问题。目的基因的导入可以用病毒或质粒作载体。病毒载体虽然有转染效率高的优点，但存在安全性问题。逆转录病毒DNA可能随机插入宿主细胞基因组内，导致细胞的恶变；腺病毒本身的表达产物可激发机体的免疫反应。以质粒为载体单独或与脂质体等包裹一起直接注射转移，经许多实验表明是可行的，目的基因得到了表达，且质粒的构建，大量制备也较容易，其携带的基因片段也相对较大。脂质体可提高质粒DNA向细胞内的转移，电穿孔法同样可以提高质粒DNA的转化率。目的基因在靶细胞中表达相对来说并不十分困难，而使基因表达接近生理水平并非易事。基因表达调控的研究工作包括两方面一是定点插入目的基因；二是目的基因上游有真核生物的启动子序列。目的基因注入体内的部位很多，可根据治疗目的而定，现报道的部位有骨骼肌、心肌、肝、脾、颅内、腹膜、皮下组织、静脉、动脉壁等。糖尿病分为两个类型，I型糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病，和II型糖尿病或非胰岛素依赖型糖尿病。目前对I型糖尿病治疗最常用的方法是外源性胰岛素注射治疗，许多病情较重的II型病人也需要胰岛素的治疗，但这种疗法由于注射后吸收较慢，缺乏食物反溃调节作用，不符合生理反应要求，且需重复注射。胰腺或胰岛移植技术，由于其供体来源不足且需长期免疫抑制辅助治疗，使其应用受到限制。随着近年来基因重组技术及转基因技术的迅速发展，为糖尿病的基因治疗提供了前提。糖尿病可能的基因治疗的方法包括细胞转移法及胰岛素基因直接导入法。细胞转移法根据使用的靶细胞不同可分为β细胞转移和非β细胞转移。β细胞早已被用来治疗糖尿病，但是用胰腺移植治疗糖尿病有许多困难。非β细胞系的靶细胞主要是内分泌器官的细胞系，研究得不太充分。胰岛素基因直接导入法即是把含有胰岛素基因的质粒、脂质体包被的质粒或用逆转录病毒和腺病毒介导的胰岛素基因直接转移到体内组织使其表达。近年已有一些体内直接注射基因的方法进行基因治疗糖尿病的研究。将含人胰岛素基因质粒用脂质体包被，直接通过成年大鼠的门静脉输入，7天内在鼠肝脏内可见人胰岛素基因的DNA和RNA，说明外源基因可以直接导入体内进行表达(Kaneda Y et al.J Biol Chem，1989，26412126-12129)。用重组逆转录病毒作载体，将大鼠胰岛素cDNA注入大鼠门静脉，胰岛素基因持续表达可达6个月。二周后再给大鼠腹腔注射大剂量streptozotocin(STZ)致糖尿病，转染了鼠胰岛素基因的动物有80％可存活至21天(Kolodka TM et al.Proc Natl Acad Sci USA.1995，923239-3297)。将含有肌肉特异性的人肌酐激酶启动子和人胰岛素原cDNA的质粒直接注射到肌肉组织中，4天后所有动物的血液中均可检测到人胰岛素原，2周时达到最高水平，并可持续7个月(Bartlett RJ et al.TransplantationProceedings 1998，30451-452)。糖尿病病人的急慢性并发症的发生、发展与高血糖状态有密切联系。1993年美国首次提出糖尿病的胰岛素强化治疗(DCCT)，即持续维持接近正常的血糖水平可减少并发症发生(The Diabetes Control and ComplicationsTrial Research Group.N Engl J Med 1993，329977-986)。胰岛素强化治疗的基本原则就是维持糖尿病人一定的基础胰岛素水平，然而因为目前胰岛素强化治疗中低血糖发生率高以及反复胰岛素注射，使病人产生极大的痛苦。利用电穿孔技术可以提高外源基因在肌肉中的转化率和表达量(Mir LM et al.Proc Natl Acad Sci USA 1999，964262-4267)。肌肉注射人胰岛素基因通过电穿孔对糖尿病进行基因治疗的研究，迄今未见报道。本工作把含有人胰岛素前体基因的质粒直接注射到糖尿病小鼠骨骼肌中，通过基因表达，观察了治疗，得到了较好的结果，为基因治疗人的糖尿病提供一种可能的简便有效的手段。本专利技术的目的是通过检测对比4种不同胰岛素前体基因对糖尿病小鼠血液中血糖和胰岛素浓度的影响及随时间的变化情况，以及对糖尿病小鼠死亡率的影响，找到最适合的治疗糖尿病的胰岛素前体基因。通过对人胰岛素前体基因在糖尿病小鼠骨骼肌中转录、表达及疗效等几个方面的研究，我们已经初步建立了直接肌肉注射重组人胰岛素前体基因质粒对糖尿病进行基因治疗的技术方法。本专利技术的另一个目的是提供一种含有本专利技术的基因，并能够在人肌肉组织中表达该基因的质粒。本专利技术提供了一种用于直接肌肉注射治疗糖尿病的人胰岛素前体基因，它依次由编码信号肽，B链，C链，和A连的核苷酸序列组成。在本专利技术的基因中，优选在编码C链和A链的核苷酸序列之间插入一段编码furin酶切位点的序列。在本专利技术的基因中，编码C链的核苷酸序列中最好含有天然状态下存在于该基因中的内含子。本专利技术还提供了一种含有本专利技术的基因，并能够在人肌肉组织中表达该基因的质粒。本专利技术所说的质粒可以是任何一种能够在人肌肉组织中表达本专利技术的基因的质粒。但最好是真核表达质粒pcDNA3.1(-)。如果选择病情较轻的，血糖浓度在20mmol/L左右的糖尿病小鼠，用如上的剂量和方式注射带有胰岛素前体基因的质粒pCMV-IN、pCMV-INcDNAm，那么pCMV-IN中的胰岛素前体基因比pCMV-INcDNAm中的胰岛素前体基因对糖尿病小鼠血糖水平的降低效果更好，可达50％(图4)。由此可见，我们专利技术的糖尿病基因治疗的方法可以起到降血糖的作用至少是1个月，这就可能使病人避免常规的经常性地胰岛素注射带来的痛苦和不便。4胰岛素前体基因对糖尿病小鼠血液中胰岛素浓度的影响把pCMV-IN用如上的剂量和方式注射到糖尿病小鼠骨骼肌中，用放免的方法测定血液胰岛素浓度的变化，发现经治疗的糖尿病小鼠血液胰岛素浓度明显高于对照，并接近或达到正常水平(17.95±3.8μu/ml)(图5)。本专利技术维持体内一定水平的胰岛素浓度可以预防和减少糖尿病病人急、慢性并发症的发生。5胰岛素前体基因在肌肉组织中转录产物mRNA的测定给糖尿病小鼠注射pCMV-IN、pCMV-INcDNA、pCMV-INcDNAm21天后，取其注射部位的肌肉组织约100mg，提取总RNA，用RT-PCR方法检测外源DNA在肌肉组织中转录产物mRNA。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于直接肌肉注射治疗糖尿病的人胰岛素前体基因，它依次由编码信号肽，Ｂ链，Ｃ链，和Ａ连的核苷酸序列组成。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：唐建国，王宪，尹东，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]