抗动脉粥样硬化核酸疫苗及制备方法技术

本发明专利技术提供一种抗动脉粥样硬化核酸疫苗及其制备方法。该核酸疫苗以乙肝核心蛋白为免疫载体，以增强抗原表位胆固醇酯转移蛋白Ｃ端多肽（ＣＥＴＰＣ）的免疫原性。该质粒载体非编码区中含有由多个未甲基化的胞嘧啶核苷酸和鸟嘌呤核苷酸（ＣｐＧ）基元组成的免疫刺激序列。该疫苗免疫机体后能激发机体产生抗ＣＥＴＰＣ抗体，该抗体与内源胆固醇酯转移蛋白结合后抑制其活性，调节体内胆固醇的分布与代谢，减少动脉粥样斑块的形成；同时质粒骨架上的免疫刺激序列既作为在位佐剂增强引发的体液免疫，也直接作用于动脉粥样硬化斑的形成部位，减轻免疫损伤，抑制斑块的形成。该核酸疫苗从两方面共同作用，发挥预防和治疗动脉粥样硬化的效果。

【技术实现步骤摘要】

在医学领域中，本专利技术提供的抗动脉粥样硬化核酸疫苗能用于预防和治疗动脉粥样硬化。
技术介绍
动脉粥样硬化(Atherosclersis，AS)是一种由于动脉发生退行性、增生性病变，导致管壁增厚，失去弹性和管腔缩小的常见血管病，其特点是受累的动脉内膜局部有脂质和复合糖类沉着，并伴有平滑肌细胞、纤维组织增生，其后内膜和中膜逐渐退变和钙化。本病主要累及大型肌弹力型动脉(如主动脉)和中型肌弹力动脉(以冠状动脉以及脑动脉罹患最多)，病变分布多为数个组织器官动脉同时受累，可引起整个循环系统或个别器官的功能紊乱，其中冠状动脉粥化硬化所导致的冠状动脉性心脏病即冠心病是该病导致器官病变中最常见类型。该病在欧美等发达国家发病率极高，其中冠心病已列人群死亡原因的首位。在我国该病发病率也呈上升趋势，现已跃居导致人口死亡的主要原因之列，且有年轻化的倾向。动脉粥样硬化的发生是多因素作用的结果，其病因尚未完全阐明，目前普遍认为胆固醇及与其代谢密切相关的胆固醇酯转移蛋白和热休克蛋白引起的自免疫在该病的形成中占主导地位。其中大量数据显示血浆胆固醇水平与动脉粥样硬化的形成密切相关。血液中低密度脂蛋白(LDL)是将胆固醇运输到全身器官的主要载体，高浓度的LDL及LDL胆固醇将导致动脉内膜上粥样斑块形成，造成管腔狭窄或阻塞。相反，高浓度的高密度脂蛋白(HDL)胆固醇能降低冠状动脉粥样硬化发病的危险。研究证明，HDL胆固醇每降低1％，冠心病发病的危险就升高2％-3％。在目前使用的降胆固醇的方法中，限制饮食最为常见，但由于部分患者缺乏长期顺应性或是遗传上具有高LDL水平的倾向，节食与运动并不总是有效。现已上市的调节血脂类药物以化学药物为主，这些药物都存在一定的毒副作用，且多需长期服用，使用不便。疫苗作为生物制品，具有完全不同于现有化学药物的本质和作用机制，其通过激活人自身的免疫系统，产生具有保护效力并可在体内维持相当长时间的抗体，或通过其他免疫机制治疗及预防疾病。故抗动脉粥样硬化疫苗的开发为安全有效地防治动脉粥样硬化提供了一个新思路和新方法。胆固醇酯转移蛋白(cholesteryl ester transfer protein，CETP)是一个由476个氨基酸组成的糖蛋白，它介导血浆脂蛋白间的脂类交换。通过体外分析证实CETP承担了人体血浆中胆固醇酯(CE)与三磷酸甘油酯(TG)转移的全部活性。CETP能促进中性脂在富含CE的脂蛋白(如HDL)与富含TG的脂蛋白(如LDL)间交换，从而导致HDL上CE的不断消耗与TG的逐渐富集。动物模型研究表明抑制过高的CETP的活性能极大地改变胆固醇在HDL与LDL之间的交换，从而起到抗动脉粥样硬化的作用。研究显示，CETP的C-末端60％形成紧凑结构，该部位可能存在CETP与脂质及脂蛋白结合位点，是其参与中性脂转移所必需的。CETP羧基端26个氨基酸中有16个氨基酸(461-476)是其最主要的B细胞表位，可诱导机体产生抗CETP的抗体，该抗体与内源CETP结合后抑制其活性，从而提高HDL胆固醇/LDL胆固醇比例，减少粥样斑块的形成，起到抗动脉粥样硬化的作用。另有越来越多的研究表明，异常的免疫反应在动脉粥样硬化的发病过程中起一定作用，特别是热休克蛋白(Heat shock protein，Hsp)引起的自免疫在早期硬化的形成中起着促进作用，因此如能抑制免疫损害则可阻止疾病的进一步发展。动脉粥样硬化斑中含有大量巨噬细胞，其进一步摄取胆固醇酯后形成泡沫样细胞，从而形成脂纹。Hsp是在生物体中普遍表达且有较高同源性的一类蛋白，又称为分子伴侣，其主要功能为帮助新生肽的正确折叠，防止逆境下蛋白的损伤，抵挡其他胁迫导致的细胞损伤和凋亡。由于各种生物体的Hsp同源性很高，机体免疫系统对人自身的Hsp产生交叉免疫反应，从而激活补体系统或依赖于抗体的细胞毒作用，造成对自身组织的免疫损伤，诱发动脉粥样硬化等自身免疫性疾病。在和Hsp相关的硬化斑中存在有巨噬细胞、Th1细胞以及IFN-γ、TNF-α和MCP-1等细胞因子，这些都可加速硬化斑的形成和发展。若通过免疫反应诱导机体产生IL-4、IL-10和TGF-β等细胞因子，就可诱使Th1细胞向Th2细胞转变，从而抑制病斑产生部位的Th1型细胞免疫反应，减轻免疫损伤。核酸疫苗是指将含有编码抗原蛋白目的基因的质粒载体直接注入体内，通过宿主细胞的转译系统表达目的抗原，并诱导机体产生免疫应答的一项新型疫苗。由于其在体内选择性表达目的产物，并将其以自然加工形式递呈给免疫识别系统，故兼具重组亚单位疫苗的安全性和减毒活疫苗诱导机体产生体液免疫和细胞免疫的双重性，与传统的疫苗相比具有免疫原性好，效果持久等特点。另外核酸疫苗可在工程菌中快速复制，制备提纯方法简便，大大降低了成本，已显示出巨大开发潜力和应用前景。核酸疫苗DNA骨架中除包含有编码抗原基因的区域，在其质粒载体非编码区还含有由未甲基化的胞嘧啶核苷酸和鸟嘌呤核苷酸(CpG)基元组成的免疫刺激序列(immunostimulatorysequences，ISS)。该ISS序列可作用于多种免疫活性细胞，增强非特异性免疫反应，激发淋巴细胞、单核细胞和树突状细胞扩增、成熟和分泌多种细胞因子、趋化因子以及免疫球蛋白。由于具有免疫刺激作用，ISS序列作为在位疫苗佐剂可极大增强核酸疫苗被细胞摄取后针对目的抗原产生的体液免疫和细胞免疫，在核酸疫苗的开发中具有极大的应用前景。另据最新研究表明，ISS序列在自身免疫性疾病中可直接发挥免疫调节作用，调节发病部位局部的细胞因子水平，促进Th细胞亚型间的相互转换。由于Th1细胞参与许多器官特异性自身免疫疾病，而Th2细胞则起抑制作用，ISS序列通过调节两者之间的平衡可以抑制免疫损伤的发生。另外，ISS序列的免疫刺激作用与其插入位置无关，只要位于质粒载体非编码区而不破坏其编码区的DNA序列，均可以表现出其生物活性。总之，核酸疫苗除可用于预防和治疗传染性疾病，也为治疗自身免疫性疾病及肿瘤提供了新思路，并可在心血管疾病防治领域发挥独特作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抗动脉粥样硬化核酸疫苗。本专利技术的另一目的是提供生产该抗动脉粥样硬化核酸疫苗的方法。本专利技术的还有一个目的是该抗动脉粥样硬化核酸疫苗的用途。在本专利技术的第一个方面，提供了一种抗动脉粥样硬化核酸疫苗。该质粒载体结构框架图如图1所示，除具有真核表达载体基本元件外，还包含有编码乙肝核心蛋白(HBc)的核苷酸序列，该HBc序列中已引入一个限制性内切酶的识别位点，并插入了编码人源胆固醇酯转移蛋白C端多肽(以下简称CETPC)的DNA序列。另外，该质粒骨架中插入免疫刺激序列(以下简称ISS)。由于ISS作用与其插入位置无关，故ISS可插入质粒载体骨架中非编码区的任何位置。由于人源CETP是人体内固有蛋白，被自身免疫系统所耐受，若采用CETPC直接作为免疫原则无法产生理想的免疫效果。为增强CETPC的免疫原性，打破免疫耐受，我们采用乙肝核心蛋白(HBc)颗粒作为免疫载体。HBc具有在真核细胞大量表达，并自身装配成不具传染性的病毒样颗粒的独特性质。该颗粒由240个HBc单体组成，表面呈现有120个刺突，HBc的主要免疫区(MIR)即位于刺突的尖端。HBc病毒样颗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗动脉粥样硬化核酸疫苗，其特征为含有编码乙肝核心蛋白（ＨＢｃ）的ＤＮＡ序列，并在该ＨＢｃ序列中引入编码人源胆固醇酯转移蛋白Ｃ端多肽（以下简称ＣＥＴＰＣ）的ＤＮＡ序列。该核酸疫苗质粒载体的非编码区中含有免疫刺激序列（以下简称ＩＳＳ序列）。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘景晶，茅丹，朱政，吴洁，曹荣月，宗莉，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]