一种疏血通冻干粉针制剂新制备方法技术

本发明专利技术公开了一种疏血通冻干粉针制剂新制备方法，其特征在于从水蛭、地龙中采用新的提取纯化方法得到有效部位，与药用辅料混合，制备成冻干粉针制剂，药理实验结果表明，本方法的疏血通冻干粉针剂具有更好的药理作用。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于中药制药
，具体涉及一种疏血通冻干粉针制剂新制备方法。
技术介绍
疏血通注射液由动物类中药水蛭和地龙经合理组方制成的注射剂，中医认为水蛭味咸、性平、破血逐瘀通络，用于症瘕痞块、血瘀经闭、跌打损伤，地龙味成、性寒、活血化瘀通络；疏血通注射液临床主要作用有(1)缺血性脑血管疾病脑动脉粥样硬化、脑血栓、短暂性脑缺血及机体功能障碍引起的反应迟钝、意识障碍、肢体麻木、半身不遂、口舌歪斜、语言蹇涩等；(2)心血管疾病心绞痛、心肌梗死、冠状动脉硬化等；(3)因高血压、糖尿病、肝病、肾病等引发的血管血流障碍性疾病；(4)周围血管血流障碍性疾病血栓闭塞性脉管炎、血栓性静脉炎等；(5)视网膜血管阻塞；(6)高血脂、高血粘度、高凝血症等。水蛭配地龙，是通络化瘀法的最佳组合，其有效成分为水蛭素和蚓激酶样作用物质，经分析主要为小分子肽等，小分子肽在水溶液中容易聚合，易产生沉淀，影响疏血通注射液的药效，因此，在运输、储藏、使用疏血通注射液的过程中，对外界环境要求比其它注射液的要求更高。
技术实现思路
基于上述原因，本专利技术采用新的提取纯化方法得到水蛭、地龙活性部位，与药用辅料混合制备成疏血通冻干粉针剂，本专利技术冻干粉针剂有利于药品的运输、储存和使用，很好的保持了疏血通的药理药效，药理实验结果表明，本专利技术冻干粉针剂具有更好的药理作用。本专利技术目的在于提供制备疏血通冻干粉针剂的新方法。一.工艺制法(1)本专利技术原料药重量配比为 水蛭6-7.5重量份，地龙2.5-4重量份；(2)提取方法一取水蛭、地龙，放入超声提取器中，加水，控制提取器温度0℃-5℃，低温超声裂解破碎15-30分钟，冷冻离心机离心，吸取上清液备用；方法二在室温条件下，将水蛭和地龙分别用生理盐水浸泡，使其表面充分展开，再反复用生理盐水清洗至干净，将清洗至干净的水蛭和地龙分别置于2-4倍的生理盐水中，于低温0-4℃浸渍15-30小时，过滤，将滤液与药渣分别存放备用；将药渣采用高速组织捣碎机将组织切割破碎，而后再与上述滤液混合使用匀浆器磨碎成直径小于0.5um的匀浆液，将匀浆液在-15℃以下冷冻15-30小时后取出，于低温0-4℃条件下解融，再按上述条件冷冻和解融反复至少2次，将上述冷冻和解融液置于冷冻离心机离心，得到上清液备用；方法三取地龙、水蛭经过清洗、沥干和冰冻处理后，加等重量的水和0.1％苯甲酸钠，在37℃水浴恒温搅拌匀浆20h，6000r/min离心30min，得到上清液备用；方法四取冰冻地龙、水蛭解冻后剪碎，加磷酸盐缓冲溶液制成匀浆，离心取上清液，经饱和中性盐溶液盐析，取30％——60％饱和度沉淀，透析除盐，得到透析液备用；方法五取水蛭、地龙，放水中反复清洗，，加入中性盐于低温下制成匀浆，置4℃冰箱过夜，4000r/min，冷冻离心20min，取上清液加入预冷有机溶剂溶液沉淀，离心，沉淀物经冷冻干燥制成粉，溶于水中，静置，得到上清液备用；(3)纯化方法一将上清液通过分子量为50000的滤柱进行粗滤，滤液经105-136℃流动相0.01mol/L、PH值7.2的磷酸缓冲溶液(配制方法按照中国生物制品主要原辅材料质控标准2000年版，中国生物制品标准委员会编，化学工业出版社，P13-14配置)。3.样品制备取本专利技术动干粉针剂，加入注射用水溶解完全，用多肽纯化离心管，进行离心分离，取离心液体即为样品。4.上样取上述处理的样品用微量注射器吸取定量液体，注入进样器进行检测。5.结果经过计算本专利技术各种方法得到动干粉针剂中水蛭素、蚓激酶的占活性成分的含量超过91％。三.本专利技术不同方法冻干粉针剂比活的检测1.实验原理天然水蛭素、蚓激酶的活性检测国家尚未公布标准的检测方法，根据凝血酶活性的检测方法(中国生物制品规程2000年版附录1)，依据水蛭素、蚓激酶与凝血酶是成比例结合，消耗一个凝血酶单位，相等于一个抗凝血单位(ATU)的原则，采用试管法(连续稀释法)检测水蛭素、蚓激酶的抗凝血单位的效价。2.实验材料5g/L纤维蛋白原的生理盐水溶液，注射用生理盐水(广东天之骄药物开发有限公司实验室实验室提供)冷冻干燥凝血酶(安徽桑原生物技术研究所购买，每瓶含量为500IU，用时用生理盐水稀释至每毫升含凝血酶0.5IU)3.待测样品本专利不同方法得到的冻干粉针剂(广东天之骄药物开发有限公司实验室提供)4.检测方法取10×80mm试管8支，在每支试管中加入生理盐水0.2ml(第一管不加)，于第一管中加入待测样品0.2ml；第二管中加入0.2ml，充分混匀后吸取0.2ml加入第三管，以次例推，直至加到第7管，将热压10-45分钟；再通过分子量为10000的超滤柱进一步过滤纯化，低温干燥，得到半成品；方法二取上清液上亲和柱，用PH6-8的磷酸缓冲液洗脱，再用0.1-0.3mol/l氨基己酸洗脱，收集洗脱液，低温干燥，得到半成品。方法三取上清液用0.1um的滤膜过滤，滤液用分子量50000的超滤柱进行超滤，滤液上凝胶柱，用饱和中性盐进行洗脱，洗脱液进行透析除盐，低温干燥，得到半成品(4)制剂制备将半成品药用辅料，用注射用水调整浓度后，分装到西林瓶中，进行冷冻干燥，轧盖，检测，得到冻干粉针剂。有机溶剂为丙酮或乙醇。中性盐为氯化钠或硫酸氨。亲和柱为gBenzamidine-Sepharose CL-6B、Trypsin-Sepharose CL-4B。凝胶柱为Sephadex G-25、Sephadex G-15、Sephadex G-10、Superose 12B、Superose6B Superose 4B。水蛭和地龙是干品或鲜品。二.检测分析采用高效液相色谱法对水蛭素、蚓激酶(以黄嘌呤计)进行检测。1.实验仪器waters600E型高效液相色谱仪，996PDA检测器，色谱柱日本TOSOHTSK2000SW 7.5*3002.实验药物本专利技术不同方法得到冻干粉针剂(广东天之骄药物开发有限公司实验室提供)2.色谱条件工作站millennium chromatogvaph多余的0.2ml混合液废弃，此时各试管都为0.2ml，但浓度依次为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64，第8管因不含水蛭素、蚓激酶，作为试验对照，加样结束后，放到37℃水浴使样品与凝血酶作用5-10min，再于各试管中加入5g/l纤维蛋白原溶液0.2ml，再放入37℃水浴，观察记录1-24小时结果，并进行计算。计算方法为发生凝固或沉淀的试管为无抗凝血酶活性(阴性)，不凝固或无沉淀产生的试管为具有抗凝血酶活性。5.比活性计算采用中国生物制品规程(一部)微量法，用BCATMProtein Assay测定分离组分的蛋白质含量，根据抗凝血酶活性测定结果计算每毫克蛋白质的抗凝血酶比活性。根据实验发现，天然水蛭素、蚓激酶体外测定结果与体内测定结果有正相关性。6.实验结果本专利技术冻干粉针剂的比活为203.1IU/mg. 四.不同制剂活性保持时间比较实验药物本专利技术冻干粉针剂(广东天之骄药物开发有限公司实验室提供)疏血通注射液(牡丹江友搏药业有限责任公司)实验方法将不同制剂放置在相同条件下0个月、3个月、6个月、12个月、18个月、24个月，按照上述实验三的方法进行比活检测，检测结果见表1. 表1 不同制剂的比活比较 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种疏血通冻干粉针制剂新的制备方法，其特征在于其特征包括以下步骤：（１）本专利技术原料药重量配比为：水蛭６－７．５重量份，地龙２．５－４重量份；（２）提取：方法一：取水蛭、地龙，放入超声提取器中，加水，控制提取器 温度０℃－５℃，低温超声裂解破碎１５－３０分钟，冷冻离心机离心，吸取上清液备用；方法二：在室温条件下，将水蛭和地龙分别用生理盐水浸泡，使其表面充分展开，再反复用生理盐水清洗至干净，将清洗至干净的水蛭和地龙分别置于２－４倍的生理盐水中，于低温０－４℃浸渍１５－３０小时，过滤，将滤液与药渣分别存放备用；将药渣采用高速组织捣碎机将组织切割破碎，而后再与上述滤液混合使用匀浆器磨碎成直径小于０．５ｕｍ的匀浆液，将匀浆液在－１５℃以下冷冻１５－３０小时后取出，于低温０－４℃条件下解融，再按上述条件冷冻和解融反复至少２次，将上述冷冻和解融液置于冷冻离心机离心，得到上清液备用；方法三：取地龙、水蛭经过清洗、沥干和冰冻处理后，加等重量的水和０．１％苯甲酸钠，在３７℃水浴恒温搅拌匀浆２０ｈ，６０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ ，得到上清液备用；方法四：取冰冻地龙、水蛭解冻后剪碎，加磷酸盐缓冲溶液制成匀浆，离心取上清液，经饱和中性盐溶液盐析，取３０％－６０％饱和度沉淀，透析除盐，得到透析液备用；方法五：取水蛭、地龙，放水中反复清洗，加入中性盐于低温 下制成匀浆，置４℃冰箱过夜，４０００ｒ／ｍｉｎ，冷冻离心２０ｍｉｎ，取上清液加入预冷有机溶剂溶液沉淀，离心，沉淀物经冷冻干燥制成粉，溶于水中，静置，得到上清液备用；（３）纯化：方法一：将上清液通过分子量为５００００的滤柱进行 粗滤，滤液经１０５－１３６℃热压１０－４５分钟；再通过分子量为１００００的超滤柱进一步过滤纯化，低温干燥，得到半成品；方法二：取上清液上亲和柱，用ＰＨ６－８的磷酸缓冲液洗脱，再用０．１－０．３ｍｏｌ／ｌ氨基己酸洗脱，收集洗脱液，低温 干燥，得到半成品。方法三：取上清液用０．１ｕｍ的滤膜过滤，滤液用分子量５００００的超滤柱进行超滤，滤液上凝胶柱，用饱和中性盐进行洗脱，洗脱液进行透析除盐，低温干燥，得到半成品（４）制剂制备：将半成品药用辅料，用注射用 水调整浓度后，分装到西林瓶中，进行冷冻干燥，轧盖，检测，得到冻干粉针剂。...

【技术特征摘要】
1.一种疏血通冻干粉针制剂新的制备方法，其特征在于其特征包括以下步骤(1)本发明原料药重量配比为水蛭6-7.5重量份，地龙2.5-4重量份；(2)提取方法一取水蛭、地龙，放入超声提取器中，加水，控制提取器温度0℃-5℃，低温超声裂解破碎15-30分钟，冷冻离心机离心，吸取上清液备用；方法二在室温条件下，将水蛭和地龙分别用生理盐水浸泡，使其表面充分展开，再反复用生理盐水清洗至干净，将清洗至干净的水蛭和地龙分别置于2-4倍的生理盐水中，于低温0-4℃浸渍15-30小时，过滤，将滤液与药渣分别存放备用；将药渣采用高速组织捣碎机将组织切割破碎，而后再与上述滤液混合使用匀浆器磨碎成直径小于0.5um的匀浆液，将匀浆液在-15℃以下冷冻15-30小时后取出，于低温0-4℃条件下解融，再按上述条件冷冻和解融反复至少2次，将上述冷冻和解融液置于冷冻离心机离心，得到上清液备用；方法三取地龙、水蛭经过清洗、沥干和冰冻处理后，加等重量的水和0.1％苯甲酸钠，在37℃水浴恒温搅拌匀浆20h，6000r/min离心30min，得到上清液备用；方法四取冰冻地龙、水蛭解冻后剪碎，加磷酸盐缓冲溶液制成匀浆，离心取上清液，经饱和中性盐溶液盐析，取30％-60％饱和度沉淀，透析除盐，得到透析液备用；方法五取水蛭、地龙，放水中反复清洗，，加入中性盐于低温下制成匀浆，置4℃冰箱过夜，400...

【专利技术属性】
技术研发人员：张海峰，
申请(专利权)人：张海峰，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]