本发明专利技术提供一种以水蛭和地龙的水提取物作为活性成分的制剂的ＨＰＬＣ指纹图谱建立的方法及其标准指纹图谱，尤其是疏血通注射液或其中间体的指纹图谱建立方法以及疏血通注射液或其中间体的鉴别方法。包括制备供试品溶液、制备参照物溶液和高效液相色谱测定，其特征在于，参照物为次黄嘌呤，高效液相色谱的条件为：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为磷酸二氢钾－水－甲醇梯度洗脱液，紫外检测。本发明专利技术的优点是方法简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种疏血通注射液或其中间体指纹图谱的建立方法和疏血通注射液或其中间体的鉴别方法，具体来说，是采用高效液相色谱法(HPLC)来建立疏血通注射液或其中间体指纹图谱以及用指纹图谱来鉴别疏血通注射液或其中间体。
技术介绍
疏血通注射液，是由水蛭、地龙两味药材的水提取物作为药物活性成分的中药注射剂是一种高效速效的治疗心脑血管疾病的注射剂。中国专利申请03148281.3、200410101538.8以及200510000266.7分别公开了疏血通注射液及其制备过程，前述申请的全部内容，引入本申请作为参考。水蛭作为经典的破血逐淤药物，为中国药典所收载。中国药典收载的水蛭药材品种有三种，其中作为药用主要品种为水蛭科动物蚂蟥(Whitmania pigra Whitman)。水蛭的主药成分为蛋白质、多肽、氨基酸、核酸、酶、糖类以及微量元素等。对水蛭中蛋白质、氨基酸、糖类及微量元素等成分的定性、定量研究已多有报道，主药方法为薄层色谱法、高效液相色谱法、电泳法等。其中小分子成分主要为次黄嘌呤、黄嘌呤、尿嘧啶、尿苷等，嘧啶和嘌呤均为含有N原子的不饱和的杂环化合物。地龙作为传统中药，具有清热定惊、通络、平喘、利尿之功效，为中国药典所收载。中国药典收载的地龙药材品种有四种，其中作为药用主要品种为钜引科动物参环毛蚓(Pheretima aspergillum(E.Perrier))，习称广地龙。地龙的主药成分为蛋白质、氨基酸、核酸、酶、糖类等。对地龙中蛋白质、氨基酸等成分的定性、定量研究已有报道。其中小分子成分主要为次黄嘌呤及含氮化合物。水蛭和地龙的化学成分复杂，因此，其制剂的质量控制，如果单用其中个别活性成分来说明药物质量，具有一定的片面性。要控制其质量，最好采用它的物质群整体予以控制。中药指纹图谱是指某种中药材或中成药中所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，对于有效控制中药材或中成药的质量，具有重要的意义。日本汉方药主要生产企业在20世纪80年代就已经在企业内部采用高效液相指纹图谱控制质量。德国、法国在对银杏叶提取物联合开发的过程中，发现银杏叶提取物的医疗作用是提取物所得物质群的整体作用结果，而对这样一个整体的质量控制，亦采用高效液相指纹图谱方法。美国FDA最近几年制定的植物草药指南中已经明确把指纹图谱作为混合物质群的质量控制方法(FDA.Guidance of IndustryBotanicalDrug(Draft).2000 August)。指纹图谱作为中草药及其提取物质量控制方法，目前已经成为国际共识。
技术实现思路
关于水蛭、地龙成分测定、药材鉴别以及其制剂质量控制的方法有许多报道，但对它们指纹图谱的建立方法却未见报道。本专利技术在水蛭、地龙的水提取物作为药物活性成分制剂质量控制研究的基础上，对其指纹图谱的建立方法进行了研究。本专利技术的目的是通过对水蛭、地龙的水提取物作为药物活性成分的制剂的HPLC指纹图谱研究，摸索出一种水蛭、地龙的水提取物作为药物活性成分制剂质量控制的方法，建立水蛭、地龙的水提取物作为药物活性成分制剂、尤其是疏血通注射液或其中间体的标准指纹图谱的方法，借此可将其作为质量控制及真伪鉴别的指标之一。本专利技术还同时提供了相应的标准指纹图谱。本专利技术通过下列步骤实施一种药物指纹图谱的建立方法，其中所述药物是以水蛭和地龙的水提取物作为活性成分，包括如下步骤(1)制备供试品溶液；(2)制备参照物溶液；(3)测定分别精密吸取供试品溶液与参照物溶液，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，制定指纹图谱；其特征在于，参照物为次黄嘌呤，高效液相色谱的条件为色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为磷酸盐(优选磷酸二氢钾)-水-甲醇梯度洗脱液，检测波长为220nm～300nm。其中，上述所述的药物为注射剂，尤其是溶液型注射剂、注射用无菌粉末、注射用浓溶液、混悬型注射剂或乳剂型注射剂。其中，上述所述的水蛭和地龙的水提取物是通过包含如下步骤的方法进行制备(1)水蛭、地龙用注射用水或生理盐水洗净，破碎形成匀浆，经反复冷冻和解冻(解融)，离心分离，取上清夜；(2)上清液进行超滤，得到透过液或滤液；(3)将透过液或滤液用离子交换柱层析处理；(4)将步骤(3)所得到的洗脱液进行脱盐处理，得到水蛭和地龙的提取物。或者，上述所述的水蛭和地龙的水提取物是通过包含如下步骤的方法进行制备(1)水蛭、地龙用注射用水或生理盐水洗净，低温浸渍，过虑，得到滤液和药渣；(2)药渣破碎后，与步骤(1)的滤液混合，形成匀浆，将匀浆反复冷冻和解冻，离心分离，取上清夜； (3)将上清液进行超滤，得到透过液或滤液；(4)将步骤(3)所得到的透过液或滤液进行热压处理后，再进行超滤，得到水蛭和地龙的提取物。上述所提及的水蛭、地龙，可以为干品，也可以为鲜品。上述所述的水蛭、地龙的水提取物的制备方法，其中水蛭、地龙是分别提取或者混合在一起进行提取。特别是，03148281.3、200410101538.8以及200510000266.7申请所公开的疏血通注射液制备过程，其全部内容，引入本申请作为本专利技术的一部分。作为本专利技术一具体实施方案，本专利技术提供一种疏血通注射液或其中间体标准指纹图谱的建立方法，包括如下步骤(1)标准(对照)溶液的制备取疏血通注射液或其中间体，如果需要，用微孔滤膜(0.45um)滤过，作为标准(对照)溶液；(2)参照物溶液的制备取次黄嘌呤对照品适量，精密称重，用流动相溶解、稀释，制成参照物溶液；(3)测定分别精密吸取标准(对照)溶液与参照物溶液，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，记录50分钟色谱，其中高效液相色谱条件为色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为0.01mol/L磷酸二氢钾溶液和50％甲醇的梯度洗脱液，检测波长为254±1nm。上述所述的流动相梯度，优选为 其中，柱温为室温；流速为0.8～1ml/min，优选为0.8ml/min。理论板数按次黄嘌呤计算不低于9000。其中，标准(对照)溶液的制备中，对于疏血通注射液，取注射液即可以作为标准(对照)溶液；对于疏血通注射液中间体，可以通过微孔滤膜(0.45um)滤过后作为标准(对照)溶液。其中，所述的疏血通注射液中间体，是指水蛭、地龙经浸渍、捣碎研磨、冷冻解融、分离纯化的注射用水或生理盐水的提取液，按照一定的比例混合后得到的均质溶液，其内在质量特征与成品有高度的一致性。上述所述的方法，得到的疏血通注射液或其中间体标准指纹图谱中，共有特征指纹峰有15个，其峰面积总和占总峰面积的95％以上。其中，所述疏血通注射液标准指纹图谱中，以次黄嘌呤的色谱峰的相对保留时间和相对峰面积为1，共有特征指纹峰选自1号峰相对保留时间0.325～0.344，相对峰面积0.053～0.064；2号峰相对保留时间0.477～0.493，相对峰面积0.031～0.049；3号峰相对保留时间0.522～0.554，相对峰面积0.218～0.368；5号峰相对保留时间0.728～0.736，相对峰面积0.012～0.032；S号峰(参照峰)相对保留时间1，相对峰面积1；6号峰相对保留时间1.197～1.205，相对峰面积0.0本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种药物指纹图谱的建立方法，其中所述药物是以水蛭和地龙的水提取物作为活性成分，包括如下步骤：（１）制备供试品溶液；（２）制备参照物溶液；（３）测定：分别精密吸取供试品溶液与参照物溶液，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法 测定，制定指纹图谱；其特征在于，参照物为次黄嘌呤，高效液相色谱的条件为：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为磷酸盐（优选磷酸二氢钾）－水－甲醇梯度洗脱液，检测波长为２２０ｎｍ～３００ｎｍ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李振国，
申请(专利权)人：李振国，
类型：发明
国别省市：23[中国|黑龙江]
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