用阳离子表面活性剂纯化蛋白质的方法技术

本发明专利技术提供从包含靶蛋白和污染蛋白的混合物中纯化靶蛋白的方法，该方法包括将混合物暴露在有效量的阳离子表面活性剂中，使污染蛋白优先沉淀出来并回收靶蛋白。本发明专利技术还提供根据本发明专利技术方法纯化的蛋白质。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
生物大分子、尤其是蛋白质的生产，通常包括基于物理 性质和物理化学性质来提高纯度的步骤。在这些工艺步骤中所遇到 的困难包括但不限于能够使可溶性和不溶性分子分离的'决定性条 件、在处理步骤后所需分子的回收率相对较低、工艺过程中生物活 性丧失以及蛋白质对工艺步骤条件(例如pH)较敏感。阳离子表面活性剂用于生物大分子纯化的已知用途包括l) 聚集体(包括蛋白质聚集体)的增溶；2)结合色谱柱的生物大分子的洗 脱；和3)聚阴离子的沉淀，聚阴离子例如透明质酸(HA)、核酸和肝 素(以及与聚阴离子共沉淀的分子)。阳离子表面活性剂一直用于使蛋白质聚集体增溶。Otta 和Bertini证实，可以用季铵表面活性剂Hyamine 2389 ^f吏啮齿动物肝 过氧化物酶体的活性尿酸氧化酶增溶(Otta和Bertini (1975) Acta Physiol. Latinoam. 25:451-457,该文献的内容通过引用全部结合到本 文中)。曾经发现铵表面活性剂浓度的增加会导致尿酸氧化酶(基于酶 活性)和总蛋白的溶解都增加，相对于蛋白质总量，尿酸氧化酶蛋白 的相对含量却没有增加。换句话说，用阳离子表面活性剂进行增溶 时，尿酸氧化酶蛋白相对于总的蛋白质没有选择性增溶，尿酸氧化 酶蛋白不占总蛋白质的较高百分比。因此，在这个方法中，作为季 铵表面活性剂增溶的结果，相对于蛋白质总量，尿酸氧化酶的纯度 并没有明显提高。乙氧基]乙基]苯曱铵、溴化十四烷基三 曱基铵、溴化十二烷基三甲基铵、溴化十六烷基三曱基铵。这些出 版物中提到，在各种增溶方法后，将溶液离心，每种情况下都几乎 未观察到沉淀。这一观察结果提示，大部分蛋白质或所有蛋白质不 是根据靶蛋白增溶的选择性而增溶。回收蛋白的纯度未予以说明。 美国专利第5,929,231号介绍了氯化十六烷基吡啶镜(CPC)使含淀粉 颗粒和聚集体崩解(该文献的内容通过引用全部结合到本文中)。因 此，现有技术涉及阳离子表面活性剂在颗粒生物大分子的常规、非 特异性增溶中的应用。现有技术的这些方法没有公开用阳离子表面 活性剂增加所需靶蛋白相对于总蛋白的纯度。规定的CPC处理和离心分离后，测定哺乳动物尿酸氧化 酶(得自溶解的大肠杆菌包含体)的蛋白质浓度(A)和酶活性(B)。以这 些数值之比(活性/蛋白质浓度)计算出各个分离物的比活(C)。0019图2表示从包含体制备的粗制哺乳动物尿酸氧化酶，用 0.075% CPC处理后的尺寸排阻HPLC色谱分析。尺寸排阻HPLC图A.参比标准BTG-271 scFv抗体，图 B.增溶的包含体，图C.重折叠及CPC (0.02%)沉淀过滤后对上清液 进行分析。每个峰面积和占总面积的百分比概括于紧接的下表中。以下顺序表示得自不同工艺步骤和标准的含scFv抗体的 样品第1泳道-分子量标准品；第2泳道-溶解的IB;第3泳 道-重折叠蛋白质；第4泳道-CPC沉淀；第5泳道-CPC处理 后的上清液。蛋白质是两性电解质，具有正电荷和负电荷。溶液pH和 与蛋白质相互作用的带电荷分子对该蛋白质的净电荷产生影响。当 蛋白质的净电荷为中性(等电点)时，蛋白质之间可发生强相互作用。 当溶液pH小于蛋白质等电点时，蛋白质带净正电荷，而且包括其它 蛋白质在内的阳离子分子间可存在静电排斥。0029本专利技术的目的是提供从包含靶蛋白和污染蛋白的混合物的溶液中纯化出增溶的靶蛋白的方法，该方法包括使增溶的混合物 与有效量的阳离子表面活性剂接触并回收靶蛋白。阳离子表面活性 剂是带正电荷的表面活性分子。 一般而言，这些化合物还具有至少1 个非极性脂族基。优选靶蛋白的等电点>7。在一个具体的实施方案中，溶液pH与靶蛋白等电点大致相同。在一个优选的实施方案中， 溶液pH〈靶蛋白等电点。在一个具体的实施方案中，当溶液pH〉輩巴 蛋白等电点时，溶液pH在靶蛋白等电点的l-2个pH单位范围内。 在一个具体的实施方案中，当溶液pH〉靶蛋白等电点时，溶液pH 在靶蛋白等电点的1个pH单位范围内。0030在一个具体的实施方案中， 一种或多种污染蛋白优先沉 淀出来，因此，保留在溶液中由靶蛋白所代表的蛋白质的比例增大。 例如，从革巴蛋白和污染蛋白的溶液开始，其中靶蛋白占溶液总蛋白 的20%,可以采用所提供的方法纯化靶蛋白，得到的溶液中，靶蛋 白占保留在溶液中总蛋白的30%以上、40%以上、50%以上、60%以 上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上。本文所用术语"优先沉淀"是指一种蛋白质或一组蛋白 质沉淀的程度大于另一种蛋白质或另一组蛋白质。例如，就靶蛋白 和污染蛋白的混合物而论，当20%以上的污染蛋白沉淀，而小于20% 的耙蛋白沉淀时，污染蛋白相对于靶蛋白优先沉淀。优选高百分比 的污染蛋白沉淀，而低百分比的靶蛋白沉淀。在优选的实施方案中， 30%以上的污染蛋白沉淀，而小于30%的靶蛋白沉淀；40%以上的污 染蛋白沉淀，而小于40%的靶蛋白沉淀；50%以上的污染蛋白沉淀， 而小于50%的粑蛋白沉淀；60%以上的污染蛋白沉淀，而小于60% 的靶蛋白沉淀；70%以上的污染蛋白沉淀，而小于70%的靶蛋白沉淀； 80%以上的污染蛋白沉淀，而小于80%的靶蛋白沉淀；90%以上的污 染蛋白沉淀，而小于90%的靶蛋白沉淀；95%以上的污染蛋白沉淀， 而小于95%的耙蛋白沉淀。优选小百分比的靶蛋白沉淀。例如小于 60%、小于50%、小于40%、小于30%、小于20%、小于10%、小13于5%或小于1%的靶蛋白沉淀。在一个具体的实施方案中，在实施本专利技术的纯化方法之 前，溶液中蛋白质的总量(靶蛋白加上污染蛋白)为0.1-10mg/ml。在 具体的实施方案中，在实施本专利技术的纯化方法之前，溶液中蛋白质 的总量为0.1-3mg/ml、 0.3-2mg/ml、 0.5-2mg/ml、 0.5-lmg/ml、 l-2mg/ml 或约lmg/ml。本专利技术的方法一旦给定，按惯例本领域技术人员要选择 具体所用的表面活性剂和条件(例如pH、温度、盐浓度、阳离子表面活性剂浓度、总蛋白浓度)，在此条件下实施该方法以提高具体耙蛋白的纯化效率。例如，可以比较不同pH值和表面活性剂浓度下进行的纯化，以确定最佳纯化条件。在下面的实施例部分给出了该方法的实例。在一个具体的实施方案中，在基本不减少靶蛋白回收量时， 选择尽可能高的溶液pH。在本专利技术的一个实施方案中，加入阳离子表面活性剂的 浓度为0.001%-5.0%,优选加入阳离子表面活性剂的浓度为0.01%-0.5%,更优选加入阳离子表面活性剂的浓度为0.03%-0.2%。在具体 的实施方案中，加入阳离子表面活性剂的浓度为0.01%-0.1%、 0.01%-0.075%、 0.01%-0.05%或0.01%-0.03%。在本专利技术的一个实施方案中，两亲性铵化合物具有至少1 条含有6-20个碳原子的脂族链，优选两亲性铵化合物具有至少1条 含有8-18个碳原子的脂族链。在本专利技术的一个实施方案中，所选择的两亲性铵化合物 选自十六烷基吡啶镜盐、硬脂酰胺-曱基吡啶镜盐、月桂基吡咬镜盐、 十六烷基喹淋镜盐、月桂基氨基丙酸曱酯盐、月桂基氨基丙酸金属 盐、月桂基二甲基甜菜碱、硬脂基二甲基甜菜碱、月桂基二羟乙基 甜菜碱和千索本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于纯化靶蛋白的方法，该方法包括鉴定靶蛋白和使包含增溶靶蛋白和一种或多种增溶污染蛋白的溶液与一种或多种阳离子表面活性剂接触，所述阳离子表面活性剂的量足以选择性地使一种或多种污染蛋白沉淀出来

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：M费希尔，E哈罗什，
申请(专利权)人：萨文特医药公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]