本发明专利技术涉及基质细胞衍生因子１的肽，所述肽已突变，使得其抵抗蛋白酶二肽基肽酶Ⅳ（ＤＰＰＩＶ）以及基质金属蛋白酶２（ＭＭＰ－２）的消化，但仍保持天然ＳＤＦ－１吸引Ｔ细胞的能力。突变体可粘附至自组装肽形成的膜，然后在组织损伤部位移植以辅助促进修复。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及基质细胞衍生因子1 (SDF-1)的肽，所述肽采用以下方 式突变，所述方式保留其吸引细胞的能力但使其抵抗蛋白酶(特别;l^质 金属蛋白酶2 (MMP-2)和/或二肽基肽酶IV (DPPIV/CD26))导致的灭 活。当其被递送到损伤组织时，这些突变体促进组织修复。所述肽在许多 状况(包括胃肠道或其它位置的溃疡，意外、手术或疾病造成的创伤，以 及心肌梗塞造成的心脏组织损伤)的治疗中也应当是有效的。所述肽在使 糖尿病患者对创伤、溃疡或病变引起的伤害敏感性下降的治疗中也应是有 效的。在一个特别优选的实施方式中，利用自组装肽形成的膜将SDF-1的 突变形式递送到损伤组织。
技术介绍
基质细胞衍生因子1 (SDF-1,或CXCL12)是吸引静息T淋巴细胞、 单核细胞以及CD34+干细胞的趋化因子家族中的68个氨基酸的成员。通 常发现它有两种不同的形式SDF-la和SDF-1|3，其是差异mRNA剪接的结 果(US 5,563,048 )。除了 SDF-1(3在C末端有4个氨基酸(画Arg-Phe画Lys-Met) 的延伸外，这些形式l基本上相同的。两种形式的SDF-1都以21个氨基 酸长度的信号肽起始，所述的信号肽被切割以形成活性肽(US 5, 563,048 )。 就本专利技术而言，应当理解术语"SDF-1"指的是所述肽的活性形式(即在切 割信号肽之后)，并包含SDF-la和SDF-1卩。还发现了全长68个氨基酸的SDF-1序列并不是活性所需的。具有 SDF-1至少前8个N末端残基的肽保持全长肽的受体结合和生物活性，虽 然其效力减弱。例如，SDF-1、 1-8、 1-9、 1-9 二聚体以及1-17诱导细胞内 4丐以及T淋巴细胞和CEM细胞中的趋化作用，并结合至CXC趋化因子受体4(CXCR4)。然而，天然的SDF-l在5nM下具有半最大的趋化活性， 而1-9 二聚体需要500nM，因而其效力是1/100。 1-17以及1-9单体类似物 的效力分别是SDF-1的1/400和1/3600。 C末端环化的SDF-1变体已被描 述，其具有更高的CXCR4受体结合亲和性，并且这种类型的环化可以(如 果需要)用于连接本专利技术所描迷的肽。就本专利技术而言，术语SDF-1将包括 在C末端截短但仍保持SDF-1生物学活性(即趋化T淋巴细胞和CEM细 胞以及结合至CXC趋化因子受体4 (CXCR4))的肽的形式。在最低限 度上，这些截短形式包括所述肽N末端的前8个氨基酸。SDF-1在胚胎发育期间(Nagasawa等,A^w^ 382:635-638(1996); Zou 等，A^w^ 393:595-599(1998))以及千细胞移植后(Lapidot等,祝ood 106:1901-1910(2005))造血干细胞归巢至骨髓中起关4定作用。除了在干细 胞归巢中的作用，SDF-1在心脏发生以及血管生成中也很重要。SDF-1缺 陷小鼠在围产期死亡并且在心室间隔形成、骨髓造血以及器官特异的血管 生成中有缺陷(Nagasawa等,胸w^ 382:635-638(1996); Zou等，胸w^ 393:595-599(1998))。还有报道说异常低水平的SDF-1至少部分地对糖尿 病患者的创伤愈合有损害，并且这种损害可以通过在组织损伤部位施用这 种细胞因子而逆转(Gallagher等，J. C""/歸仏117:1249-1259(2007))。在正常成年人心脏中，SDF-1持续表达，但其表达在心肌梗塞后的数 天内上调(Pillarisetti等,/"y aww油o" 25:193-300(2001)) 。 Askari等通过 心肌内移植过表达SDF-1的稳定转染心成纤维细胞并联合G-CSF治疗， 在心肌梗塞后8周增加SDF-1表达(Lancet 362:667-703(2003))。这与心脏 中更高数量的骨髓干细胞(c-Kit或CD34阳性)和内皮细胞相关，并导致 血管密度上升以及左心室功能改善。这些研究提示，天然发生的心肌修复 过程的不足部分地归结于SDF-1可用度的不够。因此，在心肌梗塞后以受 控的方式递送SDF-1可以吸引更多前体细胞从而促进组织修复(Penn等，/脱 丄07^,0/. 95(Suppl. 1):S23-S25(2004))。除此之外，SDF-1的施用可用于 改善患者尤其是糖尿病患者的创伤或溃疡的愈合。可用于在组织损伤部位持续递送药物的一个方式是通过生物相容性 膜的应用。某些肽在与低浓度的单价金属阳离子孵育时能够自组装 (U.S.5,670,483; U.S.6,548,630 )。组装导致无毒性、无免疫原性以及对于 蛋白酶相对稳定的凝胶样膜的形成。 一旦形成，膜在血清、水溶液以及细 胞培养基质中是稳定的。它们可在无菌条件下制备，能够支持细胞生长并8在移植入动物体内时緩慢地消化。这些特性使得所述的膜非常适合作为治疗剂递送的设备(US 20060148703以及20060088510)。专利技术概述本专利技术部分基于将以下作为前提的实验基质细胞衍生因子l( SDF-1 ) 在损伤的心脏组织恢复中的有益效果受该组织中高浓度的蛋白酶基质金 属蛋白酶2 (MMP-2)所限制。更具体地，我们提出MMP-2切割SDF-1 并因而消除了其吸引前体细胞至组织损伤部位的能力。为了验证这个前提，本专利技术人开发了保留吸引T细胞能力但抗MMP-2 消化的SDF-1的突变形式。所述的mSDF-l肽粘附至特别设计的由自组装 肽形成的膜，然后在心脏损伤的动物模型中验证。发现粘附至膜并植入到 实验动物心肌的mSDF-l,相对于未粘附至膜的SDF-1或mSDF-l，更大程 度地促进心脏的恢复。此外，本专利技术人发现SDF-1的截短形式保持和全长肽一样的生物活 性，第四位或第五位氨基酸上的突变保护肽不受蛋白酶消化。在本专利技术的第一个方面，本专利技术涉及SDF-1的突变形式(mSDF-l)，所 述突变形式的特征在于，未突变SDF-1的N末端的第四位和/或第五位氨 基酸改变(K P V SLS YRCPCRFFESHVARANVKHLKILN TPNCAL(^IVARLKNNNRQVCIDPKLKWIQEYLEKA LNK(SEQIDNO:52))。由此，第四位氨基酸改变为非S氨基酸和/或第 五位氨基酸改变为非L氨基酸。如上面所讨论的，如果存在前八个氨基酸 (上面序列中高亮显示的序列)，则全长SDF-1肽的截短形式保持生物活 性，并且，这些截短形式也可通过突变第四和/或第五位而具有蛋白酶抗性。 本专利技术也包括这些生物活性的截短突变体。提出了另一途径，本专利技术包括 至少包含SEQ ID NO:52的1-8位氨基酸的肽，其可选地在C末端延伸SEQ ID NO:52剩余序列(如9-68位氨基酸所示)的所有或任意部分。在所有 这些情况中，所述肽具有对应于SEQ ID NO:52所给出的序列，不同的是 第四位是非S的蛋白氨基酸和/或第五位是非L的蛋白氨基酸。就本专利技术而言，所有的肽序列都是从N末端(最左端)至C末端(最 右端)书写的，并且除非另有指定，所有的氨基酸都是"蛋白"氨基酸，即 它们是以下氨基酸的L异构体丙氨酸(A);精氨酸(R);天门冬酰 胺(N);天冬氨酸(本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的突变基质细胞衍生因子１，包括具有选自下述的通式的肽：Ｘ↓［ｐ］－ＳＤＦ－１、ｍＳＤＦ－１和Ｘ↓［ｐ］－ｍＳＤＦ－１，其中： ａ）Ｘ是蛋白氨基酸或蛋白酶保护性有机基团； ｂ）ｐ是１到４之间的整数； ｃ）ＳＤＦ－１是 一种包括ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２的至少氨基酸１－８的氨基酸序列的肽，并且其任选的在Ｃ末端延伸ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２剩余序列的全部或任意部分，所述ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２剩余序列如氨基酸９－６８所示； ｄ）Ｘ↓［ｐ］－ＳＤＦ－１具有对 Ｔ细胞的趋化活性，并且其被二肽基肽酶ＩＶ（ＤＰＰＩＶ）灭活的比率低于ＳＤＦ－１灭活比率的二分之一； ｅ）ｍＳＤＦ－１是一种包含ＳＤＦ－１Ｎ末端的第四和／或第五位氨基酸突变的ＳＤＦ－１形式； ｆ）ｍＳＤＦ－１具有对Ｔ细胞的趋化活性 ，并且其被基质金属蛋白酶２（ＭＭＰ－２）灭活的比率低于ＳＤＦ－１灭活比率的二分之一； ｇ）Ｘ↓［ｐ］－ｍＳＤＦ－１具有对Ｔ细胞的趋化活性，其被ＤＰＰＩＶ灭活的比率低于ＳＤＦ－１灭活比率的二分之一，并且其被ＭＭＰ－２灭活的比率低于ＳＤＦ －１灭活比率的二分之一。...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：R李，V赛格斯，
申请(专利权)人：布里格哈姆及韦门斯医院，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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