基因表达的靶向调节制造技术

本发明专利技术涉及利用设计成靶向特定核酸序列的ｓｎｏＲＮＡ分子或ｓｎｏＲＮＡ样分子或片段来调节基因表达的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及利用设计成靶向特定核酸序列的snoRNA分子或snoRNA样分子或片段 来调节基因表达的方法。本专利技术还涉及用于基因表达的靶向调节的修饰的snoRNA分子和修饰的snoRNA样 分子和片段。
技术介绍
小核仁RNAs (snoRNAs)包括存在于所有真核细胞中的核RNAs家族。snoRNAs集中 在细胞核中，特别是集中在核仁中，在核仁中它们在核糖体亚基合成过程中作用于修饰核 糖体RNA (rRNA)或另外参与rRNA的加工。存在两种主要种类的snoRNAs，即盒C/D snoRNAs 和盒H/ACAsnoRNAs，其分别参与2 ‘ -0-核糖甲基化和假尿苷修饰(评论见Boisvert等人， 2007，Kiss 等人，2002 和 2006)。SnoRNAs在体内作为RNA-蛋白复合体(snoRNPs)起作用，在该情形中RNA结构部 分作用为使碱基与rRNA前体配对的指导RNA，或者将修饰位点定向于rRNA上的特定序列 (在盒C/D与盒H/ACA snoRNAs的情形中)或作为分子伴侣来辅助新生rRNA前体的成熟 (例如 U3 snoRNA)。盒C/D snoRNAs依据在作用为一组盒C/D蛋白的结合位点的这一亚家族中常见的 RNA基序而命名，所述一组盒C/D蛋白包括N0P56，N0P58，TIP48，TIP49，15. 5K和高度保守的 蛋白纤维蛋白，所述纤维蛋白具有特异性2-0-甲基化酶活性。盒C/D snoRNA与干II和盒 D区5'紧接的区域包含与rRNA上特定位点互补的‘指导’序列，其指导纤维蛋白2' -0-甲 基酶在与指导RNA区互补的rRNA序列内所需要的核糖残基的2' -0H位置上添加甲基。已 经表明类似的功能从酵母一直到哺乳动物细胞都起作用。由于保守的序列组件，所以可以 利用基因组DNA序列信息来预测人盒C/D snoRNA家族的成员，并通过计算分析来预测其在 rRNA上的推定2' -0-甲基化靶位点。然而，迄今为止，在人类的情形中，并不是所有这些 种类都通过直接的实验鉴定或验证过。除了 rRNA的修饰之外，对于某些盒C/D snoRNAs已经提议了两种另外的功能。第 一，据认为一些家族成员针对其它非核糖体RNAs上的2' -0-核糖基团的甲基化，所述其 它非核糖体RNAs包括小核RNAs，其是核前mRNA剪接机制的亚基。这基本上是与对于rRNA 所观察的相同的修饰反应，但是由于其所包含的指导RNA序列而针对不同的RNA底物。第 二，据报道，盒 C/D snoRNA 家族的一个成员(HBII-52) (S. Kishore 和 S. Stamm, 2006)作用 为可变剪接因子，其可以对剪接位点的选择产生改变，影响编码5-羟色胺受体2C的6外显 子神经元-特异性转录体中的外显子5。在这一情形中，所涉及的机制是未知的，且还不清 楚HBII-52snoRNA是否也参与rRNA的修饰或者其是否定位于核仁。对于能够控制基因表达已经研究了很多年，并且多种技术是已知的，均具有优点 和缺点。例如，RNAi技术是本领域公知的。“RNAi是指在动物和植物中由双链RNA起 始的序列特异性转录后基因沉默的过程，所述双链RNA与靶RNA的区域相同且引起其降 解(例如，参见 W09932619，W00129058 和 Tuschl Chem Biochem.(化学和生物化学)2 239-245(2001))。然而，存在与RNAi技术相关的问题，不仅是人们必须利用化学手段合成 所述分子的成本问题。此外，当利用遗传方法制备RNAi分子时，可能难以适当地产生该 分子。此外，为了产生多于一种RNAi分子以靶向相同或不同的靶序列，仅仅增加了前述 问题。在获得靶向基因的高效击倒中，特别是在不产生其它基因的不需要的“非靶向(off target) ”击倒中，也产生使用RNAi的问题。因此，基因沉默或表达调节的其它或备选方法将是需要的。本专利技术的目的是消除 和/或减轻上述缺点中的至少一种。专利技术概述本专利技术部分基于本专利技术人对snoRNAs的研究和下述鉴定，即，snoRNA序列的一部 分可以用靶特异性核酸序列取代，以形成修饰的snoRNA，当所述修饰的snoRNA加入细胞 时，其或其片段能够调节包括所述靶特异性核酸序列的基因的表达。在第一方面中，提供了调节靶核酸表达的方法，所述方法包括在使snoRNA和/ 或其片段能够与靶核酸的一部分杂交的条件下使所述核酸与snoRNA相接触；且其中所述 snoRNA或其片段与所述核酸部分的杂交调节所述靶核酸的表达和/或功能或者对所述靶 核酸的表达和/或功能产生调节。所述snoRNA可以是天然snoRNA分子，或者其可以是修 饰的snoRNA分子，如下文进一步所述。还提供了用于调节靶核酸表达的修饰的snoRNA序列，所述修饰的snoRNA序列包 括基本上与靶核酸序列的一部分互补的核酸序列，其用于与所述靶核酸部分杂交且调节所 述核酸的表达。应该理解，所述修饰的snoRNA分子与本领域已知的天然snoRNA分子如分 子HBII-180C不同。一般说来，所述修饰的snoRNA分子基于天然snoRNA分子，如下文所讨 论，但是包括特别选择和引入到所述snoRNA分子中的核酸部分，以与靶核酸部分杂交且调 节其表达。本专利技术人已经观察到本专利技术所述的snoRNA分子能够下调或者减少靶RNA或蛋白 的表达/功能。不希望受到理论限制，可能的是，所述修饰的snoRNA可以在细胞内进行加 工，以便包括能够特异性杂交所述靶序列的序列的所述snoRNA分子的片段，可以具有调节 所述靶RNA的表达/功能的作用，尽管表达可以通过结合在特定基因座的DNA进行调节也 是可能的。这样的序列可以准确地或者高度特异性地对应于在本文所述的天然和修饰的 snoRNAs中存在的序列，其基本上与靶核酸序列如RNA或DNA序列的所述部分互补，或者取 决于所述序列的碱基组成和G/C含量长度可以更短，如2-10个核苷酸长。原则上，所述互 补区长度将足够长，且是这样的序列，即其足以提供通过已知的互补碱基配对原理特异性 结合所述靶RNA。本专利技术的snoRNA分子可以基于所谓的盒C/D-snoRNA或盒H/ACA-snoRNA。优选的 snoRNAs 基于盒 C/D-snoRNA。当用于本文时，短语snoRNA指通常在细胞的核浆中和/或核仁中合成和/或 起作用的小RNA分子。按照优选实施方案，本专利技术的小核RNA分子是包含盒C/D的snoRNAs。盒C/D snoRNAs的非限制性实例包括L. collosoma b2 (GenBank登记号 AF331656)，L. collosoma B3 (GenBank 登记号 AY046598)，L. collosomaB4 (GenBank 登记 号 AY046598)，L. collosoma B5 (GenBank 登记号 AY046598)，L. collosoma TS1 (GenBank 登 记号 AF331656)，L. collosomaTS2 (GenBank 登记号 AF331656)，L. collosoma g2 (GenBank登记号 AF331656)，L. col本文档来自技高网...

【技术保护点】
调节靶核酸表达的方法，所述方法包括在使ｓｎｏＲＮＡ或修饰的ｓｎｏＲＮＡ和／或其片段能够与所述靶核酸的一部分杂交的条件下，使所述核酸与ｓｎｏＲＮＡ或修饰的ｓｎｏＲＮＡ相接触；并且其中所述ｓｎｏＲＮＡ或其片段与所述核酸部分的杂交调节所述靶核酸的表达和／或功能。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】GB 2007-9-22 0718542.4调节靶核酸表达的方法，所述方法包括在使snoRNA或修饰的snoRNA和/或其片段能够与所述靶核酸的一部分杂交的条件下，使所述核酸与snoRNA或修饰的snoRNA相接触；并且其中所述snoRNA或其片段与所述核酸部分的杂交调节所述靶核酸的表达和/或功能。2.用于调节靶核酸的表达的修饰的snoRNA序列，所述修饰的snoRNA序列包括基本与 所述靶序列的一部分互补的核酸序列，所述核酸序列用于与所述靶核酸的部分杂交且调节 所述靶核酸的表达。3.根据权利要求1或2所述的方法或修饰的snoRNA序列，其中所述靶核酸序列是RNA 序列。4.根据前述权利要求任一项所述的方法或修饰的snoRNA序列，其中所述snoRNA分子 基于细胞snoRNAs，包括所谓的盒C/D-snoRNA或盒H/ACA-snoRNA。5.根据权利要求3所述的方法或修饰的snoRNA，其中所述盒C/DsnoRNAs包括 L. collosoma b2 (GenBank 登记号 AF331656)，L. collosoma B3 (GenBank 登记号 AY046598)， L. collosoma B4 (GenBank 登记号 AY046598)，L. collosoma B5 (GenBank 登记号 AY046598)， L. colIosomaTSl(GenBank 登记号 AF331656)，L. collosoma TS2(GenBank 登记号 AF331656)，L. collosoma g2 (GenBank 登记号 AF331656)，L. collosomasnoRNA-2 (GenBank 登记号 AF050095)，Τ· brucei snoRNA 92 (GenBank 登记号 Z50171，L. tarentolae snoRNA 92 (GenBank 登记号 AF016399)，T. brucei TBC4 snoRNA(SEQ ID NO 35), T. brucei sno 270 (GenBank 登记号 Z50171)和人 U14snoRNA (GenBank 登记号 NR_000022)。6.根据前述权利要求任一项所述的方法或修饰的snoRNA，其包括通常存在于所述盒 C/D snoRNAs中的一种或多种D/D'盒核酸序列。7.根据权利要求5所述的方法或修饰的snoRNA，其中所述至少一种或多种D和/ 或D'盒包含选自下列各项的序列，例如，5' -CUGA-3 ‘ ,5' -AUGA-3 ‘ ,5' -CCGA-3'， 5 ‘ -CAGA-3‘，5‘ -CUUA-3‘，5‘ -UUGG-3'和 5 ‘ -CAGC-3‘。8.根据前述权利要求任一项所述的方法或修饰的snoRNA，其中所述修饰的snoRNA分 子还包括盒C序列和/或任选地与28S rRNA互补的另一个区域或与snoRNA修饰的其它生 理学靶标互补的另一个区域。9.根据权利要求4所述的方法或修饰的snoRNA，其中编码所述snoRNA的序列包括提 供按照建立的snoRNA加工途径由内含子进行加工所必需的结构元件。10.根据权利要求7所述的方法或修饰的snoRNA，其中所述盒C序列长度为5_9个核 苷酸。11.根据前述权利要求任一项所述的方法或修饰的snoRNA，其中所述基本与靶RNA序 列的部分互补的序列基本上与内含子或外显子序列互补，或与内含子-外显子连接序列互 补，或与在所述靶核酸5'或3'非翻译区内部的区域或在所述靶核酸5'或3'非翻译区 连接处的区域互补。12.根据前述权利要求任一项所述的方法或修饰的snoRNA，其中基本上与所述靶RNA 序列的部分互补的所述核酸序列长度典型地为15-45个核苷酸。13.根据权利要求3所述的方法或修饰的snoRNA，其中所述靶RNA序列是mRNA，tRNA, miRNA或rRNA序列或RNA病毒基因组序列或来源于其的转录体。14.根据前述权利要求任一项所述的方法或修饰的snoRNA，其中所述修饰的snoRNA分子包括多于一种设计为与靶核酸分子杂交的序列。15.根据权利要求13所述的方法或修饰的snoRNA，其中所述多于一种设计为与靶核酸 分子杂交的序列可以靶向同一...

【专利技术属性】
技术研发人员：安格斯莱恩莱蒙德，小野基晴，
申请(专利权)人：敦提大学校董事会，
类型：发明
国别省市：GB[英国]