本发明专利技术描述了提高在谷氨酸棒状杆菌中以蔗糖为碳源提高氨基酸产量的方法和成分。一方面，可以通过使用在编码果糖－ＰＴＳ酶的ｐｔｓＦ基因上具有突变的菌株来实现由谷氨酸棒状杆菌的Ｌ－赖氨酸产量的提高，该突变体在编码果糖－ＰＴＳ酶的ｐｔｓＦ基因上发生突变，该菌株在以含蔗糖为碳源的培养基中生长时，所述果糖－ＰＴＳ酶衰减或阻断果糖输入细胞；并且通过在发酵培养基中提供葡萄糖异构酶来提高产量。葡萄糖异构酶可以外源方式添加，也可以在菌株中表达并输出到培养基中。在某些实施方式中，培养基也含有转化酶。另一方面，可通过制备具有ｐｔｓＦ突变和在果糖输出蛋白功能中的第二突变的谷氨酸棒状杆菌来实现Ｌ－赖氨酸产量提高。双突变将输入的果糖保留在细胞内。在某些实施方式中，该菌株还在细胞内过量表达葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶活性中的至少一种，以驱动输入的果糖去往磷酸戊糖途径来提高Ｌ－赖氨酸产量。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术总的涉及用棒状杆菌(Corynebacterium)属或短杆菌(Brevibacterium) 属细菌以蔗糖为碳源来生产氨基酸的方法和组合物。本专利技术更具体涉及用谷氨酸棒状杆菌 (Corynebacteriumglutamicum)以蔗糖为碳源生产L-赖氨酸。2.相关技术许多棒状杆菌或短杆菌的商业发酵用葡萄糖作为碳源。因此，设计许多细菌生产 培养物，以用葡萄糖为碳源优化产率和/或产量。生产商业上重要的氨基酸-L-赖氨酸已 成为特定的优化目的。由于成本和其它可能的考虑，某些地区优选使用替代性的非葡萄糖碳源。一种可 能的非葡萄糖碳源是蔗糖。蔗糖可以从例如甘蔗和甜菜中得到。不幸的是，由于微生物通 常以与葡萄糖不同的方式输送和利用蔗糖，以蔗糖为碳源，由许多微生物生产目的氨基酸 或精细化学品会遭受产率下降。这尤其可能是因为用蔗糖作为碳源的微生物本被设计为在 葡萄糖中最好地生长。谷氨酸棒状杆菌便是这样，它是最普遍用于通过发酵来生产氨基酸 (如L-赖氨酸)的微生物之一。ffittmann et al. , “ Metabolic Fluxes in Corynebacteriumglutamicum during Lysine Production with Sucrose as CarbonSource, Appl. &Enviro. Microbiol. 70 (12) :7277_7287 (2004)提示了谷氨酸棒状杆菌中利用蔗糖的代谢途径。 Wittmarm等人假定谷氨酸棒状杆菌中存在磷酸转移酶系统(PTS)作用产生的蔗糖摄入机 制，其中蔗糖在葡萄糖环处被磷酸化，随后在细胞中被水解为葡萄糖-6-磷酸和果糖。谷 氨酸棒状杆菌中的PTS是一般的糖类转移系统，该系统利用两种通常共享的胞质蛋白的组 合，所述两种蛋白被称为酶I和Hpr，分别由ptsl和ptsH基因编码，它们和离散的膜结合 EII蛋白复合物集相互作用，所述复合物分别被称为果糖_pts、蔗糖-pts、和葡萄糖-pts， 分别由ptsF、ptsS、和ptsG基因编码，它们分别优先转运果糖、蔗糖和葡萄糖(Tanaka et al, Microbiology (2008) 154,264-274)。还有两个被称为 HCgl2933 和 NCgl2934 的编码具 有未知特异性的蛋白的Pts基因。ffittmann等人也提示水解后产生的果糖从细胞中分泌出，然后通过果糖_PTS摄 入系统和甘露糖PTS摄入系统(现在认为后者和葡萄糖-PTS相同)再输入。存在多种蔗 糖摄入系统(蔗糖-PTS、果糖-PTS、和葡萄糖-PTS)，因而假设存在多种碳进入细胞的入口 是对蔗糖的表现不佳的原因。用葡萄糖生成赖氨酸的过程中，大约65%的碳进入磷酸戊糖途径(PPP)而用于生 产NADPH，所述NADPH用于合成赖氨酸。然而，用蔗糖生成赖氨酸的过程中，认为只有很小百分比的碳进入PPP，因为略少于半数总碳作为果糖-1，6_磷酸进入糖酵解。如附图说明图1所示，当野生型谷氨酸棒状杆菌在蔗糖中生长时，认为约90%会进入谷氨 酸棒状杆菌细胞的果糖作为果糖-1-磷酸通过果糖-PTS进入。果糖-1-磷酸经磷酸化而 生成果糖-1，6- 二酸。认为果糖-1，6-磷酸不经过PPP途径，很大一部分是因为6-磷酸果 糖激酶主要是不可逆酶，并且在蔗糖上生长的谷氨酸棒状杆菌中罕有果糖-1，6-二磷酸酶 活性。因此，果糖-1，6- 二磷酸将优先进入糖酵解和TCA循环，其不能为商业水平的赖氨酸 合成提供还原力。约10%的进入谷氨酸棒状杆菌的果糖被认为以果糖-6-磷酸的形式被葡萄 糖-PTS系统摄入。果糖-6-磷酸在葡萄糖-6-磷酸异构酶的作用下直接进入PPP，所述葡 萄糖-6-磷酸异构酶朝糖异生方向发挥作用而从果糖-6-磷酸生成葡萄糖-6-磷酸。谷氨 酸棒状杆菌中一条建议的蔗糖利用的代谢途径包括糖酵解和PPP旁路，如图1所示。已评估了由棒状杆菌在蔗糖上提高的赖氨酸产量。Georgi et al. , ‘‘ Lysine and Glutamate Production by Corynebacterium glutamicumon Glucose， Fructose， and Sucrose :Roles of Malic Enzyme andFructose-1，6-bisphosphatase， “ Metabolic Eng. 7 =291-301 (2005)提到了可能用于提高产量的一种方法。Georgi等人的策略据称涉及使用组成型启动子来过量表达果糖-1，6_ 二磷酸酶 基因fbp。然而，这一策略可能是不适宜的，因为这可能导致棒状杆菌菌株的生成，尽管使所 述菌株经优化在蔗糖中生长，所述菌株具有可导致在葡萄糖中的次优化生长的特征。这可 能潜在地降低了所述菌株经济活用的灵活性，可能无法根据条件改变时蔗糖或葡萄糖中的 何种在经济上更有优势来使用蔗糖或葡萄糖为碳源的方式进行。另一种据称提高棒状杆菌利用蔗糖生产赖氨酸的策略报导于W02005/059139A2 及 Becker et al. , “ Amplified Expression of Fructosel,6-bisphosphatase in Corynebacterium glutamicum increases in vivoflux through the pentose of phosphates pathway and of lysineproduction on different carbon sources, Appl. Envir. Microbiol. 71 =8587-8596 (2005) 在此策略中，果糖_1，6_ 二磷酸酶过量表达。这 据称使果糖_1，6-P返回PPP，最终增加NADPH的含量。图5显示了 Georgi等人和Becker 等人的基本策略。另一种建议的可能提高棒状杆菌用蔗糖为碳源生产赖氨酸的策略报导于Moon et al. ， “ Analyses of enzyme II gene mutants for sugartransport and heterologous expression of fructokinase gene inCorynebacterium glutamicum ATCC 13032 FEMS Microbiol. Lett. 244 =259-266(2005)。Moon证明在蔗糖中生长时，谷氨酸棒状杆菌中丙酮 丁酮梭菌(Clostridiium acetoybutylicum)果糖激酶基因的表达减少果糖从转化菌株输 出到培养基中，其还被缺乏果糖激酶活性的亲本菌株在对数生长期输出。Moon等人也证明， 缺乏果糖_pts活性但表达果糖激酶的ptsF突变体能比缺乏果糖激酶活性的突变菌株有更 高的光密度，且更好地利用输出的果糖。有假说认为，谷氨酸棒状杆菌中果糖激酶的表达使 果糖转化为果糖-6-P，然后所述果糖-6-P进入PPP旁路，可能增加赖氨酸产量，而非从细胞 输出，而以果糖-1-磷酸的形式主要通过PTS系统再输入。图6显示了 Moon等人假设的本文档来自技高网...
【技术保护点】
通过发酵生产氨基酸的方法，包括：●在发酵培养基中培养谷氨酸棒状杆菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）菌株，■所述谷氨酸棒状杆菌菌株中的果糖－ＰＴＳ酶Ⅱ的转移酶活性已被衰减或阻断，■所述发酵培养基◆含蔗糖为碳源，且◆含对在所述发酵培养基中将果糖转化为葡萄糖来说有效量的葡萄糖异构酶；及●发酵所述微生物来生产所述氨基酸。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2007-9-26 60/995,348通过发酵生产氨基酸的方法，包括●在发酵培养基中培养谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)菌株，■所述谷氨酸棒状杆菌菌株中的果糖-PTS酶II的转移酶活性已被衰减或阻断，■所述发酵培养基◆含蔗糖为碳源，且◆含对在所述发酵培养基中将果糖转化为葡萄糖来说有效量的葡萄糖异构酶；及●发酵所述微生物来生产所述氨基酸。2.权利要求1的方法，其中所述氨基酸是L-赖氨酸。3.权利要求1的方法，其中所述果糖-PTS的衰减或阻断通过破坏或缺失所述菌株的 PtsF基因来实现。4.权利要求1的方法，其中所述葡萄糖异构酶以外源方式加入所述发酵培养基中。5.权利要求1的方法，其中所述葡萄糖异构酶在谷氨酸棒状杆菌菌株内生成，并从所 述菌株输出到所述培养基中。6 权利要求1的方法，其中所述发酵培养基还包含对在所述发酵培养基中将部分蔗糖 转化为果糖和葡萄糖来说有效量的转化酶。7.通过发酵生产氨基酸的方法，包括眷在发酵培养基中培养谷氨酸棒状杆菌菌株， ■所述谷氨酸棒状杆菌菌株， 其中果糖-PT...
【专利技术属性】
技术研发人员：TP宾德，PD汉克，
申请(专利权)人：阿彻丹尼尔斯米德兰公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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