本发明专利技术提供了鸡毒支原体减毒活细菌，所述细菌表现出被鉴定为ＭＧＡ＿０６２１的蛋白质的表达降低。在某些实施方案中，减毒细菌还表现出相对于野生型鸡毒支原体细菌，选自下组的一种或多种蛋白质的表达降低：丙酮酸脱氢酶、磷酸丙酮酸水合酶、２－脱氧核糖－５－磷酸醛缩酶和核糖体蛋白质Ｌ３５。本发明专利技术还提供疫苗和使用鸡毒支原体减毒活细菌的疫苗接种方法，和生产鸡毒支原体减毒活细菌的方法。本发明专利技术提供示例性的减毒鸡毒支原体活菌株，命名为ＭＧｘ＋４７，通过蛋白质组分析，所述菌株表现出ＭＧＡ＿０６２１的表达显著降低，并且在作为疫苗防治鸡中鸡毒支原体感染而使用时安全有效。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及微生物学和免疫学领域。更具体地，本专利技术涉及针对细菌病原体的新疫苗。
技术介绍
支原体(Mycoplasmas)是属于柔膜菌纲(Mollicutes)的小型原核生物(0. 2至 0. 3 μ m)，柔膜菌纲的成员都缺少细胞壁，并且基因组较小。柔膜菌包括至少100种支原体。 支原体是人类和非人类动物以及植物中几种疾病的病原体。例如，鸡毒支原体引起家禽的 严重病症。鸡毒支原体与鸡和火鸡的急性呼吸疾病有关，还能引起猎鸟的上呼吸道疾病。此 外，鸡毒支原体被鉴定为北美家朱雀结膜炎的病因。预防并处理由鸡毒支原体感染而引起的疾病的有效策略是用减毒的鸡毒支原体 细菌的活菌株免疫。通常地，减毒活疫苗的优势包括使致病原的所有相关免疫原决定簇都 以天然形式面对宿主的免疫系统，并且由于致病原能在已接种疫苗的宿主体内扩增而使需 要免疫剂的量相对较少。减毒活疫苗菌株经常通过在培养基中将有毒菌株连续传代几次而产生。尽管已经 通过连续传代获得了针对鸡毒支原体的减毒活疫苗菌株，但是这些菌株通常未在分子水平 充分地鉴定。人们假定通过连续传代产生的减毒株已经积累了突变，这些突变使微生物具 有较小的毒力，但是仍然能复制。然而对于鸡毒支原体减毒株，导致毒力减弱的突变的结果 (例如，鉴别减毒株中表达模式改变的蛋白质)通常未知。因此，本领域中需要新的鸡毒支原体减毒活细菌，其已在蛋白质组水平进行表征， 并且在疫苗制剂中安全有效。
技术实现思路
本专利技术部分基于令人惊讶的发现，即在用作针对鸟类鸡毒支原体感染的疫苗时， 表现出具有SEQ ID NO :1的氨基酸序列的多肽的表达降低的鸡毒支原体细菌是安全有效。 SEQ ID NO 1 的多肽也称作 “MGA_0621”，NCBI 登录号为 NP_852784。因此，本专利技术涉及鸡毒支原体减毒活细菌，其表现出相对于野生型鸡毒支原体， MGA_0621的表达降低。在特定的、非限定性、示例性实施方案中，本专利技术提供鸡毒支原体减 毒活菌株，其表现出相对于野生型鸡毒支原体细菌，选自下组的一种或多种蛋白质的表达 降低丙酮酸脱氢酶、磷酸丙酮酸水合酶、2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶和核糖体蛋白质L35。 根据本专利技术的某些实施方案，通过蛋白质组分析将本专利技术的鸡毒支原体减毒活细菌表征为 一种或多种前述蛋白质的表达降低。根据本专利技术的一个示例性实施方案，鸡毒支原体减毒 活菌株是相对于野生型鸡毒支原体细菌表现出MGA_0621、丙酮酸脱氢酶、磷酸丙酮酸水合 酶、2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶和核糖体蛋白质L35的表达降低的菌株，所述菌株于2007 年6月19日在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)， P.O.Box 1549, Manassas, VA 20108保藏，并且分配登录号PTA-8485。这个菌株在本文中也5称作“鸡毒支原体菌株MGx+47”或“MG-P48”。本专利技术还提供包含本专利技术的鸡毒支原体减毒活细菌的疫苗组合物，以及为动物接 种疫苗防止鸡毒支原体感染的方法。此外，本专利技术提供产生和/或鉴定鸡毒支原体减毒克 隆的方法。根据本专利技术的这个方面，方法包括使鸡毒支原体细菌的初始群落经受减毒条件， 分析个体克隆中MGA_0621的表达相对于野生型鸡毒支原体是否降低，并且测试克隆的毒 力。根据本专利技术这个方面产生的鸡毒支原体克隆表现出MGA_0621的表达降低，并且可以可 选地表现出选自下组的一种或多种其它蛋白质的表达降低丙酮酸脱氢酶、磷酸丙酮酸水 合酶、2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶和核糖体蛋白质L35。优选地，表现出至少一种前述蛋白 质表达降低的菌株还表现出相对于野生型鸡毒支原体细菌的毒力降低。附图说明图1是表示鸡毒支原体减毒株MGx+47的蛋白质点的二维(2_D)聚丙烯酰胺凝胶 照片。编号为19、49、74、108、114、127、147、166、175和225的圈起的点对应于相对于野生 型菌株R-980而在MGx+47中上调的蛋白质。编号为40、68、98、99、130、136和217的圈起 的点对应于相对于野生型菌株R-980而在MGx+47中下调的蛋白质。具体实施例方式本专利技术涉及适用于疫苗制剂中的鸡毒支原体减毒活细菌。本专利技术的鸡毒支原体表 现出称作MGA_0621的蛋白质的表达降低。在某些实施方案中，本专利技术的鸡毒支原体细菌还 表现出相对于相同种类的野生型鸡毒支原体细菌中以下蛋白质的表达，选自下组的一种或 多种其它蛋白质的表达降低丙酮酸脱氢酶、磷酸丙酮酸水合酶、2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩 酶和核糖体蛋白质L35。MGA_0621的NCBI登录号为NP_852784，包含下述162个氨基酸序列MTR TMKNKKAKKKERRFTDLSADLDEEVEKIDPEYEDFKEIKIEKNKDNQVIDKNDPFFYSESFEEARIQLIKD KKVEVKKEEEKVQETTVKNKISEAKKEEAKDVYIDSSLEIASQEPLTKGMHFYTNSRIIRKVRECAKNKG LSISRLITMILDKSIKEE(SEQ ID NO :1)。鸡毒支原体蛋白质的表达降低本领域的普通技术人员将能使用常规分子生物学技术，确定鸡毒支原体减毒细菌 是否表现出一种或多种蛋白质的表达降低，所述蛋白质在野生型鸡毒支原体细菌细胞中正 常表达。可以通过本领域已知的几种方法确定相对于野生型细菌，减毒细菌是否表现出特 定蛋白质(例如，MGA_0621、丙酮酸脱氢酶、磷酸丙酮酸水合酶、2-脱氧核糖_5_磷酸醛缩 酶、核糖体蛋白质L35等)的表达降低。示例性方法包括，例如，定量的基于抗体的方法，比 如Western印迹、放射免疫分析(RIA)和酶联免疫吸附测定(ELISA)，其中使用检测目的蛋 白(protein of interest)并与目的蛋白连接的抗体。此外，因为信使RNA(mRNA)水平通 常反应其编码的蛋白质的量，所以定量的基于核酸的方法也可以用来确定鸡毒支原体减毒 细菌中一种或多种蛋白质的表达是否降低。例如，定量反转录/聚合酶链式反应(RT-PCR) 方法可以用于测定对应于特定的目的蛋白质的mRNA的量。本领域中公知很多基于核酸的 定量方法。下文为非限定性的示例性方法，可用于确定鸡毒支原体减毒细菌是否表现出蛋白质诸如MGA_0621的表达降低。首先，使减毒的鸡毒支原体细胞的群落和野生型鸡毒支原体细胞的群落在基本相 同的条件下，在基本相同的培养基中生长。接着，使两个细胞群落经受细胞破坏条件。破坏 后的细胞(或其包含蛋白质的部分)平行地进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然 后使用可以与鸡毒支原体MGA_0621蛋白质结合的抗体(比如能使用本领域公知的标准方 法获得的抗体)进行Western印迹。然后使用标记的二抗，提供与来自细胞的蛋白质量成 比例的可测量的信号。如果鸡毒支原体减毒株显示的信号量小于野生型鸡毒支原体菌株显 示的信号量，那么可以推断相对于野生型菌株，减毒株中MGA_0621的表达降低。对这个示 例性方法的修改，以及其替代方法，对于本领域的普通技术人员显而易见。本专利技术包括鸡毒支原体减毒细菌，其与野生型菌株中观察到的蛋白质表达相比， 表现本文档来自技高网...
【技术保护点】
鸡毒支原体减毒活细菌，其表现出相对于野生型鸡毒支原体，具有ＳＥＱＩＤＮＯ：１的氨基酸序列的蛋白质的表达降低。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2007-9-11 60/993,447鸡毒支原体减毒活细菌，其表现出相对于野生型鸡毒支原体，具有SEQ ID NO1的氨基酸序列的蛋白质的表达降低。2.权利要求1的细菌，其中所述细菌表现出相对于野生型鸡毒支原体，所述蛋白质的 表达降低至少25%。3.权利要求2的细菌，其中所述细菌表现出相对于野生型鸡毒支原体，所述蛋白质的 表达降低至少50%。4.权利要求3的细菌，其中所述细菌表现出相对于野生型鸡毒支原体，所述蛋白质的 表达降低至少75%。5.权利要求1的细菌，其中所述细菌还表现出相对于野生型鸡毒支原体，丙酮酸脱氢 酶的表达降低。6.权利要求1的细菌，其中所述细菌还表现出相对于野生型鸡毒支原体，磷酸丙酮酸 水合酶的表达降低。7.权利要求1的细菌，其中所述细菌还表现出相对于野生型鸡毒支原体，2-脱氧核 糖-5-磷酸醛缩酶的表达降低。8.权利要求1的细菌，其中所述细菌还表现出相对于野生型鸡毒支原体，核糖体蛋白 质L35的表达降低。9.权利要求1的细菌，其中所述细菌还表现出相对于野生型鸡毒支原体，丙酮酸脱氢 酶、磷酸丙酮酸水合酶、2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶和核糖体L35的表达降低。10.疫苗组合物，其包含(a)鸡毒支原体减毒活细菌，其表现出相对于野生型鸡毒支原体，具有SEQID N0:1的 氨基酸序列的蛋白质的表达降低；和(b)可药用的载体。11.权利要求10的疫苗组合物，其中所述细菌表现出相对于野生型鸡毒支原体，所述 蛋白质的表达降低至少25%。12.权利要求11的疫苗组合物，其中所述细菌表现出相对于野生型鸡毒支原体，所述 蛋白质的表达降低至少50%。13.权利要求12的疫苗组合物，其中所述细菌表现出相对于野生型鸡毒支原体，所述 蛋白质的表达降低至少75%。14.权利要求10的疫苗组合物，其中所述细菌还表现出相对于野生型鸡毒支原体，丙 酮酸脱氢酶的表达降低。15.权利要求10的疫苗组合物，其中所述细菌还表现出相对于野生型鸡毒支原体，磷 酸丙酮酸水合酶的表达降低。16.权利要求10的疫苗组合物，其中所述细菌还表现出相对于野生型鸡毒支原体， 2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶的表达降低。17.权利要求10的疫苗组合物，其中所述细菌还表现出相对于野生型鸡毒支原体，核 糖体蛋白质L35的表达降低。18.权利要求10的疫苗组合物，其中所述细菌还表现出相对于野生型鸡毒支原体，丙 酮酸脱氢酶、磷酸丙酮酸水合酶、2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶和核糖体蛋白质L35的表达降 低。19.使动物对鸡毒支原体免疫的方法，所述方法包括对动物施用免疫有效量的疫苗组 合物，所述疫苗组合物包含鸡毒支原体减毒活细菌，其相对于野生型鸡毒支原体，具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列的蛋白质的表达降低。20.权利要求19的方法，其中所述细菌表现出相对于野生型鸡毒支原体，所述蛋白质 的表达降低...
【专利技术属性】
技术研发人员：马赫什库马，穆罕麦德A卡恩，
申请(专利权)人：惠氏有限责任公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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