制备胰岛素样生长因子-1与聚(乙二醇)的偶联物的方法技术

制备赖氨酸聚(乙二醇)化IGF-I或IGF-I变体的方法，所述变体包含 的选自第27位、第65位和/或第68位赖氨酸的一个或两个氨基酸独立地 被另一个极性氨基酸取代，其特征在于培养包含表达载体的原核宿主细胞， 所述表达载体含有编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含的所述IGF-I 或IGF-I变体的N末端与前肽的C末端连接，所述前肽C末端以氨基酸 -Y-Pro终止，其中Y选自Pro、Pro-Ala、Pro-Gly、Pro-Thr、Ala-Pro、 Gly-Pro、Thr-Pro、Arg-Pro或Pro-Arg-Pro；回收并聚(乙二醇)化所述融 合蛋白；用IgA蛋白酶切割所述聚(乙二醇)化的融合蛋白；并回收所述聚(乙 二醇)化的IGF-I或IGF-I变体。所述IGF-I或IGF-I变体用于治疗神经变 性疾病，如阿尔茨默氏病。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于制备胰岛素样生长因子-I(IGF-I)与聚(乙二醇)(PEG) 的偶联物的方法、含有此类偶联物的药物组合物及使用此类偶联物的方法。
技术介绍
阿尔茨海默氏病(AD)是神经变性的日益流行形式，其导致了 65岁以 上年龄的人群中所有痴呆病例的约50%-60%。目前它影响了全世界估计 1500万人口，并且由于人群中老年人的相对增多，其流行率很可能在未来 20年至30年间增长。AD是从临床症状发作至死亡具有约8,5年平均持续 时间的进行性疾病。在与更高的心理功能相关的脑区域中锥形神经元的死 亡和神经突触的损失产生典型症状，其特征在于认知功能的严重且进行性 损伤(Francis, P.T 等，J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 66 (1999) 137-147)。 AD是世界上老年性痴呆和早衰性痴呆的最常见形式，在临床上 被认为是严重的进行性痴呆，其表现为记忆、智力功能的持续丧失和说话 紊乱(Merritt， A Textbook of Neurology, 第 6 版，Lea& Febiger, Philadelphia (1979)，第484-489页)。在神经病理学上AD的主要标志是两 个特征性损伤的存在淀粉状蛋白老年斑和神经纤维缠结(NFT)。当斑点 在^ 申经元外沉积时，在死后脑中的神经元内观察到了缠结。淀粉状蛋白斑 核心的一种主要成分是病理学上沉积的小淀粉状蛋白B肽(AB)，其被来自 淀粉状蛋白前体蛋白(APPJ的分泌酶切割(Selkoe， D.J., Physiol. Rev. 81 (2001) 741-766; Hardy, J.和Selkoe， D.J., Science 297 (2002) 353-356; Bush, A.I,和Tanzi， R.E.， Proc. Natl. Acad. Sci.美国99(2002)7317-7319)。具有 39-43残基(MW ~4 kDa)的自身聚集肽A15合成为更大APP(110-120 kDa) 的部分。APP是具有大的N末端胞外结构域、单个跨膜结构域和短的胞质尾区的I型膜内^l蛋白。Afi区跨越APP的胞外结构域和跨膜结构域部 分。关于APP参与AD中神经细胞死亡的最常见假说是淀粉状蛋白假说。 该假说假设斑点淀粉状沉积物或部分聚集的可溶性Afi触发了神经毒性级 联，从而引起与AD病理学相似的神经变性(Selkoe， D丄，Physiol. Rev. 81 (2001) 741-766; Hardy, J.和Selkoe， D.J.， Science 297 (2002) 353-356)。人胰岛素样生长因子I(IGF-I)是结构上与胰岛素相关的循环激素。传 统上认为IGF-I是促生长素在外周组织上发挥作用的主要介质。IGF-I由 70个氨基酸组成，也^皮称为生长调节素C并由SwissProt No. P01343定义。 在例如，le Bouc， Y等，FEBS Lett. 196 (1986) 108-112; de Pagter國Holthuizen， P.，等，FEBS Lett. 195 (1986) 179-184; Sandberg Nordqvist， A.C.，等，Brain Res. Mol. Brain Res. 12 (1992) 275-277; Steenbergh, P.H.，等，Biochem. Biophys. Res. Commun. 175 (1991) 507-514; Tanner, J.M.，等，Acta Endocrinol. (Copenh.) 84 (1977) 681-696; Uthne， K'， 等，J. Clin. Endocrinol. Metab. 39 (1974) 548-554; EP 0 123 228; EP 0 128 733; US 5,861,373; US 5,714,460; EP 0 597 033; WO 02/32449; WO 93/02695中提到了用途、活性及制备。IGF-I的功能调控是非常复杂的。在循环中，仅0.2 %的IGF-I以游离 形式存在，而大多数结合IGF结合蛋白(IGFBP， s)，所述IGF结合蛋白 对IGF具有很高的亲和力，并调节IGF-I的功能。可通过释放IGF-I的机 制(如通过蛋白酶蛋白水解IGFBP)局部释放所述因子。IGF-I在发育的及成熟的脑中起旁分泌作用(Werther， GA.，等，Mol. Endocrinol. 4 (1990) 773-778)。体外研究表明IGF-I对CNS中几种类型的 神经元而言是潜在的非选择性营养物质(Knusel， B.，等，J. Neurosci. 10(1990) 558-570; Svrzic， D和Schubert, D Biochem. Biophys， Res. Commun. 172 (1990) 54-60),所述神经元包括多巴胺能神经元(Knusel， B 等，J. Neurosci. 10(1990) 558-570)和少突胶质细胞(McMorris， F.A.，和 Dubois-Dalcq, M丄Neurosci. Res. 21 (1988) 199-209; McMorris， F.A等， Proc. Natl. Acad. Sci.美国83 (1986) 822-826; Mozell， R丄.，和McMorris,F.A., J. Neurosci. Res. 30 (1991) 382-3卯))。US 5,093,317提到胆碱能神经元 细胞的存活通过施用IGF-I而提高。还已知IGF-I刺激外周神经再生(Kanje， M等，Brain Res. 486 (1989) 396-398)并提高鸟氨酸脱羧酶的活性(US 5,093,317)。 US 5，861，373和WO 93/02695提到通过提高患者中枢神经系统 中IGF-I和/或其类似物的有效浓度来治疗主要影响神经胶质和/或非胆碱 能神经细胞的中枢神经系统损伤或疾病的方法。WO 02/32449涉及通过向 哺乳动物鼻腔施用包含治疗有效量的IGF-I或其生物活性变体的药物组合 物来减少或预防哺乳动物枢神经系统中局部缺血损伤的方法。IGF-I或其 变体通过鼻腔吸收并以有效减少或预防与局部缺血事件相关的局部缺血损 伤的量转运至哺乳动物的中枢神经系统中。EP 0 874 641要求IGF-I或 IGF-II用于制备药物的用途，所述药物用于治疗或预防中枢神经系统中因 AIDS相关痴呆、AD、帕金森氏病、匹克氏病、亨延顿病、肝性脑病、皮 质基底神经节综合征、进行性痴呆、具痉挛性parapavresis的家族性痴呆、 进行性核上麻痹、多发性硬化、谢耳德脑硬化症或急性坏死出血性脑炎而 引起的神经元损伤，其中所述药剂是用于在血脑屏障或血脊髓屏障外经肠 胃外施用有效量的该IGF的形式。已将降低游离IGF-I的脑水平和血清水平与AD的歉良型和家族型的 发病机理相关联。此外，IGF-I保护神经元免于AP诱导的神经毒性(Niikura， T等，J. Neu本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备赖氨酸聚（乙二醇）化ＩＧＦ－Ｉ或ＩＧＦ－Ｉ变体的方法，所述变体包含的选自第２７位、第６５位和／或第６８位赖氨酸的一个或两个氨基酸独立地被另一个极性氨基酸取代，其特征在于：　ａ）培养包含表达载体的原核宿主细胞，所述表达载体含有编码融 合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含的所述ＩＧＦ－Ｉ或ＩＧＦ－Ｉ变体的Ｎ末端与前肽的Ｃ末端连接，　ｂ）所述前肽Ｃ末端以氨基酸－Ｙ－Ｐｒｏ终止，其中Ｙ选自Ｐｒｏ、Ｐｒｏ－Ａｌａ、Ｐｒｏ－Ｇｌｙ、Ｐｒｏ－Ｔｈｒ、Ａｌａ－Ｐｒｏ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、 Ｔｈｒ－Ｐｒｏ、Ａｒｇ－Ｐｒｏ或Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ，　ｃ）回收并聚（乙二醇）化所述融合蛋白，　ｄ）用ＩｇＡ蛋白酶切割所述聚（乙二醇）化的融合蛋白，并　ｅ）回收所述聚（乙二醇）化的ＩＧＦ－Ｉ或ＩＧＦ－Ｉ变体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2006.8.31 EP 06018170.81. 制备赖氨酸聚(乙二醇)化IGF-I或IGF-I变体的方法，所述变体包含的选自第27位、第65位和/或第68位赖氨酸的一个或两个氨基酸独立地被另一个极性氨基酸取代，其特征在于a)培养包含表达载体的原核宿主细胞，所述表达载体含有编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含的所述IGF-I或IGF-I变体的N末端与前肽的C末端连接，b)所述前肽C末端以氨基酸-Y-Pro终止，其中Y选自Pro、Pro-Ala、Pro-Gly、Pro-Thr、Ala-Pro、Gly-Pro、Thr-Pro、Arg-Pro或Pro-Arg-Pro，c)回收并聚(乙二醇)化所述融合蛋白，d)用IgA蛋白酶切割所述聚(乙二醇)化的融合蛋白，并e)回收所述聚(乙二醇)化的IGF-I或IGF-I变体。2. 权利要求1的方法，其特征在于所述前肽由通式 Met-X,-His『X2-Y-Pro-表示，其中 Met表示甲硫氨酸 X,是键、丝氨酸或天冬酰胺 His是组氨酸 n是从0至10之间的数字， X2是选自肽SEQ ID NO: 6-10的接头肽， ProAM氨酸，并且 Y选自Pro、 Pro陽Ala、 Pro-Gly、 Pro-Thr、 Ala-Pro、 Gly-Pro、 Thr-Pro、 Arg-Pro或Pro-Arg-Pro 。3. 权利要求1或2的方法，其特征在于所述前肽不包含赖氨酸残基。4. 权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于所述极性氨基酸独立 地是精氨酸、谷氨酰胺或天冬酰胺。5. 权利要求1至4中任一项的方法，其特征在于所述赖氨酸聚(乙二 醇)化的IGF-I变体在第65位和第68位赖氨酸处被单聚(乙二醇)化或二聚(乙二醇)化。6. 权利要求5的方法，其特征在于所述赖氨酸聚(乙二醇)化的IGF-I 变体是RRK并且所述变体在第68位赖氨酸处^皮单聚(乙二醇)化，或所述 赖氨酸聚(乙二醇)化的IGF-I变体是RKR并且所述变体在第65位赖氨酸 处被单聚(乙二醇)化。7. 权利要求5的方法，其特征在于所述赖氨酸聚(乙二醇)化的IGF-I 变体是RKK，并且所述变体在第65位和第68位赖氨酸处被单聚(乙二醇) 化或二聚(乙二醇)化。8. 权利要求5的方法，其特征在于所述赖氨酸聚(乙二醇)化的IGF-I 变体是RRK、 RKR或RKK的混合物，并且所述变体在第65位和第68 位赖氨酸处被单聚(乙二醇)化或二聚(乙二...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·费舍尔，F·赫西，H·克内根，K·朗，F·梅茨格，J·T·雷古拉，C·尚茨，A·肖布马尔，H·J·舍恩菲尔德，
申请(专利权)人：弗·哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：发明
国别省市：CH