病原体控制基因及其在植物中的使用方法技术

本发明专利技术提供了为植物赋予提高的病原体抗性的方法。本发明专利技术具体涉及产生具有提高的线虫抗性的转基因植物的方法、包含编码具有线虫抗性活性的多肽的多核苷酸的表达载体，和由其产生的转基因植物和种子。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本申请要求2007年8月31日提交的美国专利申请系列号60/969，190和2007年 8月31日提交的系列号60/969，211的优先权。本专利技术涉及病原体的控制。本文公开了产生具有增强的病原体抗性的转基因植物 的方法，以及包含编码功能蛋白的多核苷酸的表达载体，和由其产生的转基因植物和种子。背景植物生物技术的一个主要目标是生产出具有有益新特性的植物，如，提高农业生 产率，提高食品质量，生产特定的化学药品或医药品。植物对病原体的天然防卫机制通常不 够。从植物、动物或微生物引入外源基因能提高这种防卫能力。具有农业经济重要性的一大群植物病原是线虫。线虫是一种微型线虫动物，其以 超过2000种中畦作、蔬菜、水果和观赏性园艺植物的根、叶和茎为食，在世界范围内造成约 1000亿美元的作物损失。多种寄生的线虫物种感染作物植物，其中包括根癌线虫(RKN)，胞 囊形成和病斑形成线虫。根癌线虫具有在进食部位造成根菌瘿形成的特性，具有相对广泛 的宿主范围，因此对许多作物种类具有致病性。囊胞形成和病斑形成的线虫的宿主范围较 窄，但仍然会在易感作物中造成很大损失。致病线虫遍布美国，在南部和西部温暖、潮湿的地区及沙壤土地区密度最大。大豆 胞囊线虫(大豆胞囊线虫(Heterodera glycines))这种对大豆植物影响最严重的害虫，是 于1954年在美国的北卡罗来那被发现的。大豆胞囊线虫(SCN)在一些地区大量遍布，以至 于不采取控制措施，大豆产量将不再具有经济性的可能。虽然大豆是受大豆胞囊线虫侵袭 的主要经济作物，大豆胞囊线虫还寄生于总共约五十种寄主，包括田地作物、蔬菜、观赏性 园艺植物和野草。线虫损害的迹象包括阻碍叶片生长并使之变黄，在热时期中使植物萎蔫。然而， 线虫侵袭能在地上部分不具有明显病症而导致严重的减产。减产的主要原因是地下根的损 伤。大豆胞囊线虫感染的根系矮小或生长受阻。线虫侵袭也能减少根系的固氮根瘤数目， 并可能使根对更易受其它土壤传播的植物病原体攻击。线虫的生命周期有三个主要阶段虫卵、幼虫期和成虫期。不同种的线虫有不同的 生命周期。比如，在最佳条件下，大豆胞囊线虫的生命周期通常能在24到30天里完成，而 其它种的线虫可能需要一年，甚至更久来完成其生命周期。在春天，当温度和湿度变得更适 宜时，蠕虫型的幼虫在土壤里从卵中孵化。只有幼虫发育阶段的线虫能侵袭大豆根系。大豆胞囊线虫的生命周期一直是很多研究的课题，这些研究对了解线虫生命周期 是很有用的。在穿透了大豆根系之后，大豆胞囊线虫幼虫越过根，直到能接触到维管组织， 此时，它们停止迁移并开始进食。线虫用口针注射入分泌物以修饰一些根细胞，使其变为专 门的进食部位。根细胞在形态学上转变成大的多核合胞体(或就根癌线虫而言的巨型细 胞)，并成为线虫的营养来源。活跃进食的线虫从而从植物中得到主要的营养，并使植物减产。当雌性线虫进食 时，它们的身体会鼓起来，最终变得非常大，以致突破根系并暴露到根表面上。在一段进食期后，雄性大豆胞囊线虫(作为成虫并膨胀)从根里移进土壤中，对变4大的成熟雌虫进行受精。之后，雄虫死亡，雌虫依然附着于根系之上，继续进食。膨胀的雌 虫体内的卵开始发育，最初在体外的团块或卵囊中，之后在线虫的体腔里。最终，整个成熟 的雌虫体腔装满卵，线虫死亡。死亡的雌虫的装满卵的躯体就是胞囊。最后，胞囊从雌虫体 内移出，游离在土壤里。胞囊壁变得非常坚硬，可以为里面大约200-400个卵提供非常好的 保护。大豆胞囊线虫卵在胞囊里存活，直到适当的孵化条件出现。虽然许多卵可能在第一 年孵化，但很多卵也将在胞囊的保护下生存许多年。线虫凭借自己的力量，每年在土壤里只能移动几英寸。但是，线虫侵袭可以以多种 方式散布很大距离。任何可以移动被感染的土壤的东西都能散布这种感染。包括农业机械、 交通工具和工具、风、水、动物和农场工人。种子大小的土壤颗粒经常污染收获的种子。结 果是，在非侵染田地中播种来自受侵染田地的污染种子时，可以传播线虫侵染。甚至有证据 表明某些线虫物种能够通过鸟传播。这些起因中仅有一些可以预防。管理线虫侵染的常规实践包括在线虫侵染的土地中保持合理的土壤养分和土壤 PH水平；控制其他植物疾病以及昆虫与杂草病害；使用环境卫生实践，如仅在操作了非侵 染田地工作后才翻耕、播种和中耕受线虫侵染的田地；在受侵染田地中工作后用高压水或 蒸汽彻底清洁设备；不使用在受侵染田地上培育的种子播种非侵染田地，除非该种子已经 被恰当地清洁过；轮作受侵染田地并且用非宿主作物替换宿主作物；使用杀线虫剂；和播 种抗性植物品种。已经提出了用于遗传地转化植物旨在赋予提高的植物寄生线虫抗性的方法。美国 专利号5，589，622和5，824，876涉及鉴定线虫附着后在植物摄食部位内部或其附近特异性 表达的植物基因。但是，这些专利没有提供用于赋予线虫感染抗性的任何特定线虫基因。即便在植物生物技术的某些领域中取得若干项进展，然而在植物中取得病原体抗 性方面的成功还是很有限的。因病原体所致、尤其因线虫侵袭引起的产量损失是个严重问 题。减少线虫侵染的现有操作主要限于高强度地施加杀线虫剂。因此，需要鉴定安全和有 效的组合物和方法用于控制植物病原体、尤其线虫，和用于产生具有提高的植物病原体抗 性的植物、并且最终用于提高产量。专利技术概述本专利技术使植物具有线虫抗性的需求得到实现，并达到植物增产。本专利技术的转基因 植物具有微生物基因，该基因在植物里表达时，会使植物具有对病原体抗性提高的表型。在第一实施方案里，专利技术提供了线虫抗性的转基因植物，该植物被转染了用于过 量表达、包含分离的多核苷酸的表达载体，其包含的多核苷酸选自(a)具有如SEQ ID NO 1、3、5、7、9、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159 或 161 所示序列的 多核苷酸；(b)编码具有如 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、136、138、140、142、144、146、148、150、 152、154、156、158、160 或 162所示多肽序列的多核苷酸；(c)与 SEQ ID NO :1、3、5、7、9、135、 137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159 或 161 所示序列的多核苷酸有 70% 的序列同一性的多核苷酸，其中，所述核苷酸赋予植物提高的线虫抗性；(d)编码与SEQ ID NO :2、4、6、8、10、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160 或 162 所示多 肽序列有70%的序列同一性的多肽的多核苷酸，其中，所述核苷酸赋予植物提高的线虫抗 性；(e)多核苷酸，其在严格地条件下与包括具有如SEQ ID NO :1、3、5、7、9、135、137、139、 141、143、145、147、149、151、153、155、157、159或161所示序列的多核苷酸杂交，其中，核苷酸赋予植物提高的线虫抗性；(f)多核苷酸，其在严格地条件下与包含编码具有如SEQ ID NO :2、4、6、8、10、136、138、140、142、144、146、148本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含多核苷酸的表达载体，包所述多核苷酸选自：ａ）具有如ＳＥＱＩＤＮＯ：１、３、５、７、９、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９或１６１所示序列的多核苷酸；ｂ）编码ＳＥＱＩＤＮＯ：２、４、６、８、１０、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０或１６２所示多肽序列的多核苷酸；ｃ）与ＳＥＱＩＤＮＯ：１、３、５、７、９、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９或１６１所示序列的多核苷酸有７０％的序列同一性的多核苷酸，其中多核苷酸对植物赋予提高的线虫抗性；ｄ）与ＳＥＱＩＤＮＯ：２、４、６、８、１０、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０或１６２所示多肽序列有７０％的序列同一性的的编码多核苷酸，其中多核苷酸对植物赋予提高的线虫抗性；ｅ）多核苷酸，其在严格地条件下与包括具有如ＳＥＱＩＤＮＯ：１、３、５、７、９、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９或１６１所示序列的多核苷酸杂交，其中多核苷酸对植物赋予提高的线虫抗性；以及ｆ）多核苷酸，其在严格地条件下与编码包括具有如ＳＥＱＩＤＮＯ：２、４、６、８、１０、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０或１６２所示多肽序列的多核苷酸杂交，其中多核苷酸对植物赋予提高的线虫抗性。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2007-8-31 60/969,190;US 2007-8-31 60/969,211包含多核苷酸的表达载体，包所述多核苷酸选自a)具有如SEQ ID NO1、3、5、7、9、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159或161所示序列的多核苷酸；b)编码SEQ ID NO2、4、6、8、10、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160或162所示多肽序列的多核苷酸；c)与SEQ ID NO1、3、5、7、9、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159或161所示序列的多核苷酸有70％的序列同一性的多核苷酸，其中多核苷酸对植物赋予提高的线虫抗性；d)与SEQ ID NO2、4、6、8、10、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160或162所示多肽序列有70％的序列同一性的的编码多核苷酸，其中多核苷酸对植物赋予提高的线虫抗性；e)多核苷酸，其在严格地条件下与包括具有如SEQ ID NO1、3、5、7、9、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159或161所示序列的多核苷酸杂交，其中多核苷酸对植物赋予提高的线虫抗性；以及f)多核苷酸，其在严格地条件下与编码包括具有如SEQ ID NO2、4、6、8、10、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160或162所示多肽序列的多核苷酸杂交，其中多核苷酸对植物赋予提高的线虫抗性。2.权利要求1所述的表达载体，还包括一个或更多的转录调控因子，与权利要求1所述 的一个或更多的多核苷酸有效的连接。3.权利要求2所述的表达载体，其中转录调控元件为(i)调控植物里有效连接的多核 苷酸的组成型...

【专利技术属性】
技术研发人员：P普齐奥，R阿申齐，V米腾多夫，
申请(专利权)人：巴斯夫植物科学有限公司，
类型：发明
国别省市：DE