基于Ｇ４ＤＮＡ酶显色的可视化基因检测试剂的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种基于Ｇ４ＤＮＡ酶显色的可视化猪瘟病毒基因检测试剂的制备方法，包括选取病毒感染后的细胞，经冻融裂解后，采用基因提取试剂盒提取目标基因，经逆转录、灭活ＭＭＬＶ逆转录酶后得到ｃＤＮＡ；将ｃＤＮＡ加入不对称ＰＣＲ体系，经变性、退火及延伸扩增５０－１００个循环得到不对称ＰＣＲ产物；将上、下游探针和不对称ＰＣＲ产物加入到Ｇ４ＤＮＡ酶显色反应缓冲液中，经变性、退火后再加入Ｈｅｍｉｎ、ＡＴＢＳ和Ｈ２Ｏ２进行显色反应，观察有无肉眼可见的绿色出现，可判定有无猪瘟病毒感染。本发明专利技术检测速度快、精确稳定、重现性好、检测步骤简单、操作简便、可肉眼直接观察显色反应，结果直观、成本低廉。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
基于Ｇ↓［４］ＤＮＡ酶显色的可视化基因检测试剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：Ａ、目标基因的提取选取经猪瘟病毒感染后的ＰＫ－１５细胞，经－７０℃冻融３次，每次１０－３０分钟后，取２００μｌ加ＲＮＡ裂解液１ｍｌ混匀，室温静置１０－１５分钟，加０．２ｍｌ氯仿，再室温静置３－５分钟，于４℃　１２０００ｇ／ｍｉｎ离心１０－１５分钟，上清液转移到另一个离心管，加０．５ｍｌ异丙醇，室温沉淀１０－２０分钟，再于４℃　１２０００ｇ／ｍｉｎ离心１０分钟，轻轻倒出上清，加１ｍｌ　７５％乙醇于４℃　７５００ｇ／ｍｉｎ离心５分钟，弃上清，ＲＮＡ沉淀在室温下自然晾干，加ＤＥＰＣ处理过的水２０μｌ得到目标基因ＲＮＡ；Ｂ、ｃＤＮＡ的制备采用基因提取试剂盒取步骤Ａ所得到的目标基因ＲＮＡ　１０μｌ，加入反向引物　Ｗ３（－）１μｌ（２０μｍｏｌ／Ｌ）和ｄＮＴＰｓ　１μｌ（１０μｍｏｌ／Ｌ），６５℃孵育５分钟，再迅速置冰上５分钟，然后加逆转录反应缓冲液４μｌ（５×ｂｕｆｆｅｒ），ＲＮＡ酶抑制剂１μｌ，ＤＴＴ　２μｌ（０．１ｍｏｌ／Ｌ），ＭＭＬＶ逆转录酶１μｌ，于４２℃反应５０分钟、７５℃反应１０分钟，即得到ｃＤＮＡ；Ｃ、不对称ＰＣＲ的扩增取步骤Ｂ制好的ｃＤＮＡ　５μｌ，加入到１００μｌ的不对称ＰＣＲ体系中进行反应，循环条件为：９５℃预变性２分钟；９４℃变性１５　秒，５３℃退火　１５秒，７２℃延伸１５秒，扩增５０－１００个循环；最后７２℃延伸１０分钟，得到ＰＣＲ产物；Ｄ、Ｇ↓［４］ＤＮＡ酶显色反应分别取Ｇ↓［４］ＤＮＡ酶显色反应缓冲液２０μｌ，上游探针Ｐｒｏｂ１Ｌ　２μｌ（２０μｍｏｌ／Ｌ）和下游探针Ｐｒｏｂ１Ｒ　２μｌ（２０μｍｏｌ／Ｌ），加无菌双蒸水补足为９１μｌ，加入至Ｄ步骤所得的含有１００μｌ不对称ＰＣＲ反应液的２００μｌ　ＰＣＲ管中，９５℃变性５　ｍｉｎ；３０℃退火３ｍｉｎ，加入Ｈｅｍｉｎ底物０．５μｌ（５０ｍｍｍｏｌ／Ｌ），放置５ｍｉｎ，再加入８μｌ（５０　ｍｍｏｌ／Ｌ）ＡＴＢＳ和０．５μｌ　（１　ｍｏｌ／Ｌ）Ｈ↓［２］Ｏ↓［２］显色，观察有无肉眼可见的绿色出现。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王毅，鲁小璐，
申请(专利权)人：成都巨星猪业有限公司，王毅，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]