一种基于DAB显色的低温CPC乙酰化酶高通量筛选的方法，该方法基于对二甲氨基苯甲醛与7-ACA的复合物在405nm有最大吸收峰的原理，采用无菌的96孔板对重组菌进行低温低浓度诱导剂诱导表达，以稀碱溶液进行菌体裂解后利用磷酸二氢钠中和，然后再以96孔板进行底物的水解，经p-DAB显色后利用酶标仪进行产物的快速定量，进而实现CPC乙酰化酶突变体的高通量筛选。该方法具有筛选快速、操作简便、筛选通量大及准确度高等优点，能够加快CPC乙酰化酶改造的速度，有巨大的应用潜力和经济价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及生物工程
，具体的说是一种基于DAB显色的低溫CPC乙酷化酶 (即头抱菌素 C乙酷化酶)高通量筛选的方法。
技术介绍
所述7-ACA的化学名称为3-乙酷氧甲基-5-硫-7-氨基-8-氧-1-氮杂二环辛-2-締- 2簇酸，是玉米浆通过头抱菌发酵得到的头抱菌素 C，头抱菌素 C在酷胺键处水解得到7-AcA， 其结构如右：d7-ACA是合成头抱类抗生素的重要中间体，其 传统的制备途径是将头抱菌素 C(C邱halosporin C，CPC)通过化学方法的脱乙酷化处理而 成，化学法需要苛刻的反应条件，并且会产生一些有毒的物质。与传统的化学方法相比，新 型的生物催化法具有安全性高、环境友好、选择性强及设备投入低等优势。生物催化法常见 的主要有两步酶法和一步酶法。两步酶法所使用的关键酶是D-氨基酸氧化酶和戊二酷-7- 氨基头抱烧酸乙酷化酶，CPC在两个酶的先后作用下可W转化成7-ACA。经过多年的发展，两 步酶法的工艺已经日趋成熟，并在工业生产中得到了广泛应用，但是两步酶法副产物多、酶 的制备及生产工艺相对复杂的缺陷依然存在。一步酶法是CPC在头抱菌素 C(即CPC乙酷化 酶）的作用下可W直接转化成7-ACA，运种途径更能简化生产工艺、降低生产成本，在工业生 产中更具吸引力。由于7-ACA在20°CW上极不稳定、易产生其它副产物，为了获得高质量的 7-ACA，它的合成往往需要在低溫环境下进行，工业上7-ACA的生产一般控制在13°C左右。而 现有的CPC乙酷化酶最适溫度较高、在低溫环境下催化活性较低，低溫环境下必须得提高加 酶量，增加了生产成本。目前，国内外均还没有成功开发出最适溫度低于20°C的低溫CPC乙 酷化酶的研究报道。 目前，由于对酶适冷机制的认识尚缺乏统一的定论，创制低溫酶常用的方法仍W 定向进化或点饱和突变技术为主。目前，常用的CPC乙酷化酶活性的测定方法主要有碱滴定 法、P-DAB比色法和HPLC法，其中碱滴定法主要是用在工业生产中简单、粗糖、快速地评估头 抱菌素 C乙酷化酶的活性。HPLC法能够非常准确地测定7-ACA的量进而准确地计算出头抱菌 素 C乙酷化酶的活性，但受仪器所限，测定速度较慢而且很难实现高通量的测定。传统的P- DAB比色法，由于前人所述的终止液对反应的终止效果有限，也不太适合高通量的测定。
技术实现思路
本专利技术目的是为解决上述技术问题的不足，提供一种基于DAB显色的低溫CPC乙酷 化酶高通量筛选的方法，其可快速、准确从海量的突变文库中获得低溫CPC乙酷化酶。[000引本专利技术为解决上述技术问题所采用的技术方案是:一种基于DAB显色的低溫CPC乙 酷化酶高通量筛选的方法，该方法基于对二甲氨基苯甲醒 （P- dimethylaminobenzaldehyde, p-DAB)与7-ACA的复合物在405nm有最大吸收峰的原理，采 用无菌的96孔板对重组菌进行低溫低浓度诱导剂诱导表达，W稀碱溶液进行菌体裂解后利 用憐酸二氨钢中和，然后再W96孔板进行底物的水解，经P-DAB显色后利用酶标仪进行产物 的快速定量，进而实现CPC乙酷化酶突变体的高通量筛选。 一种基于DAB显色的低溫CPC乙酷化酶高通量筛选的方法，更具体的操作方法，优 选为W下方案;包括如下步骤： 步骤一、CPC乙酷化酶的高通量表达:从抱菌素 C乙酷化酶饱和突变的突变文库中挑选 单菌落的突变子接种至装有含有浓度为100 yg/mL氨节青霉素的200化LB培养基的无菌 聚苯乙締板中，置于37°C下、200 rpm培养过夜;将过夜培养的产物用移液器接种到300 μL 的LB液体培养基中，接种量为300化的LB液体培养基体积的4%;然后，置于37°C下、200 rpm 培养2.5 h，最后加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG水溶液，置于30°C下、200巧m培养8 h，得 到诱导后的菌液，备用； 步骤二、菌体的碱裂解:将步骤一所得诱导后的菌液置于8000 g离屯、1 min,去上清后， 将菌体重悬于300化的100 mmol/L、pH8.0的憐酸盐缓冲液，加入1化溶度为Img/mL的 Dnase水溶液后縱满振荡，加入50化Imol/L的化0H水溶液裂解细胞，振荡30 S混匀后静置 2 min,然后加入50 μL Imol/L K出P化水溶液进行中和;混匀后置于11000 g离屯、10 min,收 集上清液，收集到的上清液即为CPC乙酷化酶粗液； 步骤S、7-ACA含量标准曲线的制作：用0.1 mol/L、p册.0的憐酸缓冲液配制终浓度为 1.5 mg/血的7-ACA，用1 mol/L的化0H调抑值至8.0,分别取0、1、2、4、6、8、12、16和20化的 7-ACA于离屯、管中，再用0. lmol/L、p册.0的憐酸缓冲液补足到20 yL，向离屯、管中加入20 μL 13°C预热3 min的CPC乙酷化酶，混匀，得到混合物A，将混合物A置于13°C水浴10 min后，加 入体积为混合物A体积5倍的终止液，混匀后12000巧m离屯、3 min,取200 yL的上清与40 μL 的显色剂显色，室溫静置10 min后取200化测405 nm的吸光值，W〇号为空白对照，W7-ACA 的含量为纵坐标、405 nm的吸光值为横坐标制作标准曲线，并求出回归方程； 步骤四、7-ACA高通量的快速定量:用0.1 mol/L的憐酸缓冲液配制20 g/L的头抱菌素 C 作为底物，用1 mol/L的NaOH水溶液调节抑至8.0,取20化底物与20化稀释后的CPC乙酷化 酶粗液于96孔板中混匀，13°C解育10 min,得到混合物B;向混合物B中加入体积为混合物B 体积5倍的终止液进行终止反应，取200化的上清与40化的显色剂显色，室溫反应10 min 后取200化利用96孔板在酶标仪上测405 nm的吸光值； 步骤五、CPC乙酷化酶活性的计算在测定条件下每分钟产生1 μπιο? 7-ACA所需的酶 量定义为一个酶活单位(IU);进而用EXCEL计算出各个突变体在低溫下的酶活； 所述终止液，由质量百分比浓度为20%的乙酸水溶液与0.05 mol/L的化0H水溶液按体 积比2:1的比例混匀； 所述显色剂，用甲醇配制的质量百分比浓度为0.5%的二甲氨基苯甲醒。 所述聚苯乙締板优选为伽11(3"96〇669胖611"聚苯乙締板。 所述移液器优选为8通道的移液器。 有益效果是： 本专利技术基于DAB显色的低溫CPC乙酷化酶高通量筛选的方法对传统的P-DAB比色法做了 的改进，利于后续高通量的测定。利用传统的表达及筛选策略从海量的突变文库中筛选目 标低溫酶注定是一项费时费力的工作，传统的CPC乙酷化酶表达及活性测定的方法也不能 满足快速筛选的需求。因此，建立快速、准确的低溫CPC乙酷化酶高通量筛选的方法是从海 量的突变文库中获得低溫酶的重要保障，具有十分重要的意义;该方法具有筛选快速、操作 简便、筛选通量大及准确度高等优点，能够加快CPC乙酷化酶改造的速度，有巨大的应用潜 力和经济价值。【附图说明】 图1是本专利技术中7-ACA含量的标准曲线图； 图2是本专利技术中CPC乙酷化酶及其突变体的SDS-PAGE分析图； 图中标记是本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于DAB显色的低温CPC乙酰化酶高通量筛选的方法，其特征在于：基于对二甲氨基苯甲醛与7‑ACA的复合物在405nm有最大吸收峰的原理，采用无菌的96孔板对重组菌进行低温低浓度诱导剂诱导表达，以稀碱溶液进行菌体裂解后利用磷酸二氢钠中和，然后再以96孔板进行底物的水解，经二甲氨基苯甲醛显色后利用酶标仪进行产物的快速定量，进而实现CPC乙酰化酶突变体的高通量筛选。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：唐存多，史红玲，阚云超，姚伦广，唐青海，焦铸锦，史鸿飞，周军事，马晨露，
申请(专利权)人：南阳师范学院，
类型：发明
国别省市：河南;41
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