一种微生物产酶发酵酶法生产抗病毒药物利巴韦林的工艺制造技术

一种利用基因工程菌产酶发酵，微生物酶法生产抗病毒药物利巴韦林的生产工艺。构建高效表达冷适应嘌呤核苷磷酸化酶的基因工程菌ＤＨ５α（ｐＱＦ－ＸｍＰＮＰ），优化冷适应酶表达条件，采用该工程菌，以葡萄糖、酵母膏、豆浓、玉米浆、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸亚铁、微量元素和自来水为原料，进行产酶发酵，以所得菌体为酶源，以鸟苷和ＴＣＡ（１，２，４－三氮唑－３－羧甲酰胺）为底物，５０℃反应生产利巴韦林。本发明专利技术降低了传统酶法反应温度，降低了能耗，产酶效率高，底物转化率高，环境污染程度低，工艺简单，降低了生产成本。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术属于生化工程领域，涉及一种基因工程菌产酶发酵酶法生产抗病毒药物利巴韦林的工艺。
技术介绍
：利巴韦林(ribavirin)，化学名为1-β-D-呋喃核糖基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酰胺，别名病毒唑，是一种广谱抗病毒药物，对多种DNA和RNA病毒均有显著抑制作用，在抗病毒临床实践中得到广泛应用。利巴韦林生产方法有化学合成法、发酵法和酶法三类。目前，国内在工业生产上实施的化学合成法占绝大多数，存在副产物多，产率低，操作步骤多，污染严重，成本高等不足。添加前体物发酵法(日本公开专利17830/1979；陈宁，200710057650)虽具有原料成本低，来源广泛，能耗低等优点，但是不足之处在于生产效率低，副产物多，利巴韦林分离纯化成本高，必须每次培养菌体且发酵时间长，生产成本高，目前仍处于实验室研究阶段。酶法由Witkowski等首创，在上个世纪80、90年代发展起来，先后经历了三个主要阶段：一是以纯酶催化核糖-1-磷酸和TCA(1，2，4-三氮唑-3-羧甲酰胺)一步式生产利巴韦林(US Patent 3,976,545/1976)；二是以自然界筛选的或人工诱变本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种微生物产酶发酵酶法生产抗病毒药物利巴韦林的工艺，即利用自行构建的高表达冷适应嘌呤核苷磷酸化酶的基因工程菌DH5α(pQF-XmPNP)产酶发酵，以鸟苷和TCA(1，2，4-三氮唑-3-羧甲酰胺)为底物，微生物酶法生产利巴韦林，其特征在于该生产工艺包括：A.利用分子生物学技术构建高表达冷适应嘌呤核苷磷酸化酶的基因工程菌DH5α(pQF-XmPNP)：利用同源序列PCR技术由低温菌Pseudoalteromonas sp.XM2107中扩增冷适应嘌呤核苷磷酸化酶编码基因，与启动子部分经改造的表达载体pQE-30连接，构建了具有较高表达效率和很高质粒稳定性的表达载体pQF-XmPNP和工程菌DH5α(pQF-XmPNP)。B.工程菌高密度产酶发酵：将步骤A中获得的经扩大培养的菌种接入发酵培养基进行工程菌高密度产酶发酵，发酵培养基中碳源含量应为0.2％～4％，氮碳比N∶C应介于20∶100～80∶100之间，无机盐含量应为0.1～12％，发酵培养基的初始pH7.2～7.8，培养温度30℃～36℃，振荡培养或发酵罐培养12～20h，接种量为2％～10％(V/V)；发酵过程中，添加氨水调节发酵液的pH值维持在7.2～7.5；C.酶源制备：将步骤B发酵完毕后离心产酶发酵液，菌体用50mmol/...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈宁，夏俊刚，谢希贤，徐庆阳，刘淑云，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：12