本发明专利技术是以Ｎ－乙酰－ＤＬ－２－氨基脂肪酸为原料的固定化细胞酶法制备Ｌ－２－氨基脂肪酸的方法。将发酵得到的含氨基酰化酶的微生物细胞用不同固定化载体包埋装柱，使一定浓度的Ｎ－乙酰－ＤＬ－２－氨基脂肪酸水溶液以一定速度流经固定化细胞填充柱，收集流出液，浓缩结晶或用阳离子交换柱分离纯化得Ｌ－２－氨基脂肪酸和Ｎ－乙酰－Ｄ－２－氨基脂肪酸，其中Ｎ－乙酰－Ｄ－２－氨基脂肪酸经消旋后再次用于酶柱拆分。Ｎ－乙酰－Ｌ－２－氨基脂肪酸的摩尔转化率达９６％以上，Ｌ－２－氨基脂肪酸收率高于８５％。本发明专利技术生产工艺简单、微生物细胞利用率高、适合工业化生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及利用固定化微生物细胞酶法制备L-2-氨基脂肪酸的方 法，更具体的说本专利技术涉及将含氨基酰化酶的微生物细胞固定化，通 过固定化细胞内酶的作用将底物N-乙酰-DL-2-氨基脂肪酸拆分为L-2-氨基脂肪酸和N-乙酰-D-2-氨基脂肪酸，N-乙酰-D-2-氨基脂肪酸经消 旋后再次酶法拆分又可得到L-2-氨基脂肪酸。属酶工程
二
技术介绍
2-氨基丁酸是抑制人体神经信息传递的脂肪族氨基酸，临床可用 于脑血管病后遗症，并具有降压作用；2-氨基丁酸还是一种重要的化 工原料和医药中间体，已广泛应用于药物合成，如盐酸乙胺丁醇、左 乙拉西坦等。2-氨基戊酸(正缬氨酸)是合成药物培哚普利的关键中 间体，此外在枯草芽孢杆菌产生的一种抗真菌多肽中也发现了正缬氨 酸。2-氨基己酸(正亮氨酸)也是一种应用广泛的药物中间体。根据 目前文献报导，以上三种2-氨基脂肪酸的制备方法主要有以下三种 1、化学法2007年，奚强等(武汉工程大学学报，Vol. 29， No.4， 2007)以 正丁酸和溴为原料合成了 2-溴丁酸，再以2-溴丁酸与氨水反应制备 了 DL-2-氨基丁酸，其收率为62.5%。2007年，陈新志等(CN 101007772A, 2007)以正丁醛、氰化钠 和氯化铵为原料首先制备了氨基戊腈，经腈基酰胺化、L-酒石酸拆分、水解等步骤得到L-正缬氨酸。 .2006年，陈新志等(CN 100427460C, 2006)以正戊酸为原料， 经酰氯化、溴化、氨化得到外消旋2-氨基戊酰胺，利用L-酒石酸拆 分后水解得到L-正缬氨酸。2004年，王旭(CN 100352801C， 2004)以正丁醛和丙酮氰醇为 主要起始原料，依次经过氰基化、氨化、氰基酰胺化得到外消旋2-氨基戊酰胺，利用L-酒石酸拆分后水解得到L-正缬氨酸。1991年，Tadashi等(Bull. Chen. Soc. Jpn.， 64， 1991)以N-乙 酰-L-丙氨酸铵盐为共溶物，以替代结晶法在乙醇中光学拆分了 N-乙 酰-DL-氨基丁酸铵盐、N-乙酰-DL-正缬氨酸铵盐以及N-乙酰-DL-正 亮氨酸铵盐，其中N-乙酰-L-正缬氨酸铵盐收率达800/0。1986年，Compagnone等(J. Org. Chem.， 51(10)， 1986)将L-蛋氨酸在T-1雷尼镍作用下脱去甲硫基生成L-2-氨基丁酸。1978年，Jeffery等(Aust. J. Chem.， 31(1)， 1978)利用荥电极 在氨水或氯化铵溶液中电催化还原其相应的酮式氨基酸(或氨基酸钠 盐)的方法，制备了DL-2-氨基丁酸，产率仅为48%，且有副产物谷 氨酸生成。1970年，Mahendra等(Canadian Journal of Chemistry, 48， 1970)以氢氰酸加成希夫碱的方法不对称合成了正缬氨酸、正亮氨酸以及亮 氨酸，收率40%-60%。其具体步骤为利用甲基苄胺和脂肪醛制备 希夫碱，然后氢氰酸加成得到氨基腈，酸水解得到N-取代的氨基酸， 加氢催化得到苯乙烷和a-氨基酸。1965年，Babievskii等(Seriya Khimicheskaya， No.l， 1965)将硝基乙酸甲酯、乙醛和乙酰氯的反应产物经催化加氢后得DL-2-氨基 丁酸甲酯，水解后制备了 DL-2-氨基丁酸，产率较低还有副产物苏氨 酸生成。1954年，Losse等(Chemische Berichte， 87(9)， 1954)利用手性 拆分剂D-酒石酸或联苯甲酰-D-酒石酸拆分DL-2-氨基丁酸分别得到其对应光学异构体。2、 发酵法2000年，Tomoihiro等(JP 2000279163 (A)， 1983)利用高红曲 生产L-2-氨基丁酸。1997年，Andrey等(Applied and Environmental Microbiology, Dec. 1997)利用重组大肠杆菌生物合成了 L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-正缬氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸，收率80%以上。1983年，中西俊秀等(JP 63287493 (A), 1983)采用大肠杆菌属 或谷氨酸棒杆菌属的微生物发酵法制备了 L-2-氨基丁酸。1977年，Masahiko等(Applied and Environmental Microbiology, Aug. 1977)以Serratiamarcescens正亮氨酸耐受突变株发酵法积累正 亮氨酸。3、 酶法2009年，焦庆才等(CN 200910030982.8， 2009)利用微生物来 源或基因工程来源的氨基酰化酶，以N-乙酰-DL-2-氨基丁酸为底物制 备了L-2-氨基丁酸，收率达78%以上。62008年，Daniel等(Eur. J. Org. Chem.， 2008， 3506-3512)利用碱性蛋白酶A在醛存在的条件下动态拆分DL-正缬氨酸乙酯得到L-正缬氨酸。2008年，苗维娟等(过程工程学报，8(1)， 2008)将甘油脱氢酶 和亮氨酸脱氢酶偶联，以甘油和2-丁酮酸为底物，同时合成l, 3-二 羟基丙酮和L-2-氨基丁酸。.1999年，Fotheringham等(Bioorganic & Medicinal Chemistry, 7 (10)， 1999)利用大肠杆菌K12菌体细胞以L-苏氨酸和L-天冬氨酸 为底物通过转氨反应合成了 L-2-氨基丁酸。1989年,Chenault等(J. Am. Chem. Soc.， 1989， 6354-6364)以 猪肾和米曲霉来源的氨基酰化酶I拆分了 N-乙酰-DL-氨基丁酸、N-乙酰-DL-正缬氨酸等50几种N-乙酰-a-氨基酸及其衍生物。1945年，Greenstein等(Journal of Biological Chemistry, 182(2)， 1945)利用猪肾中提取的氨基酰化酶不对称水解N-氯乙酰外消旋正 亮氨酸、正缬氨酸和a-氨基丁酸得到了其对应的L-型和D-型异构体， 其中L-型和D-型的收率分别为70%和60%。利用游离细胞或酶转化制备L-2-氨基脂肪酸，转化液中会含有少 量菌体蛋白或其它杂质，不利于产物的分离纯化，菌体细胞或酶的重 复利用率也不高。到目前为止，利用固定化含氨基酰化酶的微生物细胞酶法制备 L-2-氨基脂肪酸的方法还未见报导。 三、
技术实现思路
1、 专利技术目的本专利技术目的在于提供一种固定化微生物细胞酶法制备L-2-氨基 脂肪酸的方法。2、 技术方案一种利用固定化微生物细胞酶法制备L-2-氨基脂肪酸的方法，其 特征在于制备步骤如下(1) 细胞固定化将发酵获得的含氨基酰化酶的菌体细胞和包埋剂混合均匀，加入 成型剂中固化成型，或固化成型后再加入强化剂进行强化处理，即得 固定化细胞；(2) N-乙酰-DL-2-氨基脂肪酸生物转化将固定化细胞装柱，使N-乙酰-DL-2-氨基脂肪酸水溶液流经酶柱 进行生物转化，收集流出的转化液，转化液重复上柱，直至转化液中 N-乙酰-L-2-氨基脂肪酸反应完全；(3) L-2-氨基脂肪酸分离纯化 上述转化液用活性炭脱色去除杂质，浓縮、冷却结晶或用活性炭脱色除杂质后用阳离子交换柱分离，得到L-2-氨基脂肪酸和N-乙本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种固定化微生物细胞酶法制备Ｌ－２－氨基脂肪酸的方法，其制备步骤如下： （１）细胞固定化 将发酵获得的含氨基酰化酶的菌体细胞和包埋剂混合均匀，加入成型剂中固化成型，或固化成型后再加入强化剂进行强化处理，即得固定化细胞； （ ２）Ｎ－乙酰－ＤＬ－２－氨基脂肪酸生物转化 将固定化细胞装柱，使Ｎ－乙酰－ＤＬ－２－氨基脂肪酸水溶液流经酶柱进行生物转化，收集流出的转化液，转化液重复上柱，直至转化液中Ｎ－乙酰－Ｌ－２－氨基脂肪酸反应完全； （３）Ｌ－２－氨基脂 肪酸分离纯化 上述转化液用活性炭脱色去除杂质，浓缩、冷却结晶或用活性炭脱色除杂质后用阳离子交换柱分离，得到Ｌ－２－氨基脂肪酸和Ｎ－乙酰－Ｄ－２－氨基脂肪酸，其中Ｎ－乙酰－Ｄ－２－氨基脂肪酸经消旋，得Ｎ－乙酰－ＤＬ－２－氨基脂肪酸再次用 于酶柱拆分。
【技术特征摘要】
1、一种固定化微生物细胞酶法制备L-2-氨基脂肪酸的方法，其制备步骤如下(1)细胞固定化将发酵获得的含氨基酰化酶的菌体细胞和包埋剂混合均匀，加入成型剂中固化成型，或固化成型后再加入强化剂进行强化处理，即得固定化细胞；(2)N-乙酰-DL-2-氨基脂肪酸生物转化将固定化细胞装柱，使N-乙酰-DL-2-氨基脂肪酸水溶液流经酶柱进行生物转化，收集流出的转化液，转化液重复上柱，直至转化液中N-乙酰-L-2-氨基脂肪酸反应完全；(3)L-2-氨基脂肪酸分离纯化上述转化液用活性炭脱色去除杂质，浓缩、冷却结晶或用活性炭脱色除杂质后用阳离子交换柱分离，得到L-2-氨基脂肪酸和N-乙酰-D-2-氨基脂肪酸，其中N-乙酰-D-2-氨基脂肪酸经消旋，得N-乙酰-DL-2-氨基脂肪酸再次用于酶柱拆分。2、 根据权利要求1所述的固定化微生物细胞酶法制备L-2-氨基脂肪 酸的方法，其特征在于步骤(1)中所述含氨基酰化酶的菌体为刺孢 小克银汉霉9980、米曲霉、基因工程菌1016或基因工程菌DM202。3、 根据权利要求1所述的固定化微生物细胞酶法制备L-2-氨基脂肪 酸的方法，其特征在于步骤(1)中所述菌体细胞和包埋剂混合后的 浓度为10 200g/L，在成型剂中固定化时间为1 48h,强化剂处理时间为10 180min。4、 根据权利要求1所述的固定化微生物细胞酶法制备L-2-氨基脂肪 酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：焦庆才，刘均忠，陈争依，董凯，赵根海，刘茜，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
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