本发明专利技术公开了一组针对Ｍ基因检测甲型Ｈ１Ｎ１流感病毒２００９变异株的核苷酸序列和试剂盒。该Ｈ１Ｎ１流感病毒２００９变异株的核苷酸序列如序列表ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ：１至ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ：３，其中序列ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ：１和ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ：２分别为检测Ｈ１Ｎ１流感病毒２００９变异株Ｍ基因的正义引物和反义引物，序列ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ：３为检测Ｈ１Ｎ１流感病毒２００９变异株Ｍ基因的ＬＮＡ修饰的荧光探针。本发明专利技术进一步公开了含有上述引物和探针的检测Ｈ１Ｎ１流感病毒２００９变异株的试剂盒。本发明专利技术所述的试剂盒具有快速、灵敏、特异、通用性好、重复性好及不易污染的特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及针对M基因检测甲型Him流感病毒2009变异株的核苷酸序列和试 剂盒，尤指快速的基于LNA修饰的短探针荧光RT-PCR针对M基因检测甲型Hmi流感病毒 (2009变异株)的核苷酸序列和试剂盒，不仅适用于不同动物组织样本中甲型Hmi流感病 毒(2009变异株)的准确检测，还可适用于不同动物活体样本(主要为拭子样品)的甲型 Hmi流感病毒(2009变异株)的检测，可用于动物甲型Hmi流感病毒(2009变异株)的筛 查，出入境检疫等，属于检验检疫领域。
技术介绍
2009年4月由墨西哥开始的甲型Hmi流感疫情造成了全球大流行。对该病毒的 序列进化分析显示，该病毒为一个新型甲型流感变异株，其基因序列与人季节性Hmi流感 病毒和经典Hmi猪流感病毒存在明显差异。序列分析显示它的8个基因片段具有明显特 殊性。但其HA片段与北美猪流感病毒HA片段同源性最高，为95%左右；NA和M为欧亚猪 源病毒片段最为相近，同源性分别为92%和97%。因此为在实际的诊断与检测中，采用核 酸扩增方法进行鉴别时，必须进行仔细的序列比对分析。目前研究已经证明该毒株可自然感染猪和犬等多种哺乳动物。2009年5月3日加 拿大报道，加西部艾伯塔省一猪场的猪身上检测出这种Hmi流感病毒，此后很多学者又从 犬、猫等动物体内检出该病原。由上可知该病毒的跨物种传播能力较强。目前新型的核酸扩增检测方法发展快速，由于其简便快捷，结果准确，已经在临床 检疫中广泛应用，取得了良好的效果，目前已有替代传统检测方法的趋势。尽管在甲型Hmi 流感暴发后，国内外很多学者研究建立了荧光RT-PCR检测方法。但所有检测方法都依据特 异性的HA序列建立。我们对甲型Hmi流感病毒(2009变异株)M基因与其他Hmi流感病 毒M基因进行大量比对后，发现所有甲型Hmi流感病毒(2009变异株)M基因815-817编码 氨基酸为苏氨酸，而其余Hmi流感病毒编码亮氨酸。但依据此差异设计的探针与一些Hmi 流感病毒相应位置基因差别仅2个核苷酸，为此我们采用LNA修饰探针方法可进一步提高 探针识别位点的特异性，基于此，我们设计了 LNA修饰的短探针可特异性识别甲型Hmi流 感病毒(2009变异株)。LNA，又名锁核酸，作为一种新颖的核苷酸衍生物在生物学研究领 域引起了人们的广泛关注，它是一种特殊的双环状核苷酸衍生物，结构中含有一个或多个 2' -0,4' -C-亚甲基-β-D-呋喃核糖核酸单体，核糖的2' -0位和4' -C位通过不同的 缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋 喃糖C3'-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定 性。对DNA、RNA有很好的识别能力和强大的亲和力。LNA和DNA、RNA互补的双链有很强的 热稳定性(ΔΤπι = 3 8°C )，具有抗3'脱氧核苷酸酶降解的稳定性，合成方法相对简单， 部分或完全修饰的LNA寡核酸链可用氨基磷酸法在DNA自动合成仪上合成。本研究为保证方法的特异性，保证探针的匹配性，我们在大量序列分析基础上，在3国内首次设计LNA修饰的短探针用于检测甲型Hmi流感病毒(2009变异株)，缩短了探针 的核苷酸数量，并提高了方法的特异性和灵敏度。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一组特异性强、灵敏度高的针对M基因检测甲型Hmi 流感病毒(2009变异株)的核苷酸序列，包括引物序列和基于LNA修饰的短探针序列。本专利技术的另一个目的是提供快速、准确、使用方便的基于LNA修饰的针对M基因检 测甲型Hmi流感病毒(2009变异株)检测试剂盒。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案选择甲型Hmi流感病毒(2009变异株)的M基因核苷酸序列与其他A型流感病 毒M基因编码区特定序列作为靶区域，在多重序列比对的基础上，进行引物和探针设计。引 物长度为20个碱基左右，GC含量为50% -60%，引物内无二级结构和重复性，引物间和引 物内无互补序列，引物间的熔解温度(Tm值)相差小于5°C。探针的长度在12 15个碱基 左右，采用LNA修饰，并标记荧光基团。一组针对M基因检测甲型Hmi流感病毒(2009变异株)核苷酸序列，如下1)5，-ATC ATT GGG ATY TTG CAC-3 ‘ (SEQ ID NO 1)2)5，-CGTAGAAGG CCC TCT TTT C_3，(SEQ ID NO 2)3) 5，- [FAM] -TA CT GA TC GT CT ΓΤΤ- [TAMRA 或 BHQ1] -3，(SEQ ID NO 3)Y代表嘧啶，此处为T或C ；其中序列1)和2)分别为检测甲型Hmi流感病毒(2009变异株)M基因的正义引 物和反义引物，序列3)为检测甲型Hmi流感病毒(2009变异株)M基因的LNA修饰的荧光 短探针，用斜体表示的碱基用LNA进行修饰，即第3、5、7、9、11、13位的碱基用LNA进行修 饰，探针的5’端标记报告荧光基团FAM(6-carb0Xy-荧光素)，3’端标记淬灭基团TAMRA或 BHQl。我们采用TaqMan荧光RT-PCR检测技术建立了甲型Hmi流感病毒(2009变异株) M基因检测方法，对反应的各种条件进行了优化，其中包括引物探针的筛选，Mg2+使用浓度 的优化，引物探针浓度的优化，得到以下试剂盒。检测甲型Hmi流感病毒(2009变异株)M基因的LNA修饰短探针检测试剂盒，由 以下组分组成1)裂解液购自INVITR0GEN公司，按15ml/瓶进行分装，2瓶/盒。2) RT-PCR反应液，表1为反应液配方。表IRT-PCR反应液配方组分终浓度5 X RT-缓冲液0.5 X RT-缓冲液10 X PCR缓冲液0.5XPCR缓冲液25mM MgCl22.5mmol/L MgCl22.5mM dNTP0.2mmol/L dNTP正义引物0.3 μπιοΙ/L反义引物0.3 μπιοΙ/L甲型HlNl流感病毒(2009变异株)M基因LNA 短探针0.3 μιηοΙ/L10XPCR 缓冲液、25mM MgC12 购于 Promega 公司；5XRT-缓冲液，2. 5mM dNTP 购 自大连宝生物生物工程有限公司，引物和探针均委托大连宝生物生物工程有限公司合成， 其中 10 XPCR 缓冲液的组成为500mmol/L KC1、100mmol/L Tris-HCl (pH9. O, 25°C ) >1. O% Triton X-100。5XRT-缓冲液组成为 375mmol/L KCl、15mmol/L MgCl2、50mmol/L DTT, 250mmol/L Tris-HCl(pH8. 3，25°C )。3) RT-PCR酶颗粒，购自AMERCIA公司，12粒/盒。4) Taq DNA 聚合酶 5U/ μ L，购自 Promega 公司。5)DEPC水，用自来水两次蒸馏，经过Millipore MILLI-Q PF PLUS纯水仪纯化，收 取电阻率彡18. ΟΜΩ.αιι的水，Millipore-Q纯化水加入DEPC至终浓度为0. 1%，37°C搅拌 处理12hr，151bf/in2(1.034X105Pa)高压蒸汽灭菌1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一组针对Ｍ基因检测甲型Ｈ１Ｎ１流感病毒２００９变异株的核苷酸序列，其核苷酸序列如序列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１至ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３，其中序列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１和ＳＥＱ ＩＤＮＯ：２分别为检测甲型Ｈ１Ｎ１流感病毒２００９变异株Ｍ基因的正义引物和反义引物，序列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３为检测甲型Ｈ１Ｎ１流感病毒２００９变异株Ｍ基因的ＬＮＡ修饰的荧光探针。
【技术特征摘要】
一组针对M基因检测甲型H1N1流感病毒2009变异株的核苷酸序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1至SEQ ID NO3，其中序列SEQ ID NO1和SEQ IDNO2分别为检测甲型H1N1流感病毒2009变异株M基因的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO3为检测甲型H1N1流感病毒2009变异株M基因的LNA修饰的荧光探针。2.根据权利要求1所述的针对M基因检测甲型Hmi流感病毒2009变异株的核苷酸序 列，其特征在于所述探针序列SEQ ID NO 3的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭 荧光基团TAMRA或BHQ1，第3、5、7、9、11、13位的碱基用LNA进行修饰。3.一种针对M基因检测甲型Hmi流感病毒2009变异株的试剂盒，由以下组分组成1)裂解液；2)RT-PCR反应液，包括PCR缓冲液、RT缓冲液、MgCL2、dNTP、正义引物、反义引物和荧 光探针；3)RT-PCR酶颗粒；4)Taq DNA聚合酶；5)DEPC 水；6)...
【专利技术属性】
技术研发人员：张鹤晓，高志强，乔彩霞，蒲静，谷强，张伟，刘环，张利峰，汪琳，柏亚铎，张向东，
申请(专利权)人：中华人民共和国北京出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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