检测Ａ型流感病毒的核苷酸序列和试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一组检测Ａ型流感病毒的核苷酸序列和试剂盒。该检测Ａ型流感病毒的核苷酸序列如序列表ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１至ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３，其中序列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１和ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２分别为检测Ａ型流感病毒Ｍ基因的正义引物和反义引物，序列ＳＥＱ　ＩＤＮＯ：３为检测Ａ型流感病毒Ｍ基因的ＬＮＡ修饰的荧光探针。本发明专利技术进一步公开了含有上述引物和探针的检测Ａ型流感病毒的试剂盒。本发明专利技术所述的试剂盒具有快速、灵敏、特异、通用性好、重复性好及不易污染的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及检测A型流感病毒的核苷酸序列和试剂盒，尤指快速的基于LNA修饰 的短探针荧光RT-PCR检测A型流感病毒的通用核苷酸序列和试剂盒，不仅适用于不同动物 组织样本中A型流感病毒的准确检测，还可适用于不同动物活体样本(主要为拭子样品) 的A型流感病毒的检测，可用于动物A型流感病毒的筛查，出入境检疫等，属于检验检疫领 域。
技术介绍
流感病毒(Influenza Virus)属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，国际病毒 分类委员会(ICTV) 1995年发布的第六次分类报告，将正粘病毒科原来的1个属(流感 病毒属)分为3个属，即A、B型流感病毒属(Influenza Virus A, B)和C型流感病毒属 (Influenza Virus C)。其中B型和C型流感病毒能引起人的感染，但流行规模很小。A型 流感病毒感染范围很广，能引起人和动物的大流行。其中动物流感几乎均由A型流感病毒 引起。A型流感常以流行的形式出现，发病快，传播蔓延非常迅速，危害巨大。历史上多次 发生A型流感病毒大流行，席卷全世界，1918年发生的A型流感大流行导致死于流感的人数 甚至超过第一次世界大战死亡的人数。动物A型流感主要包括禽流感，猪流感，马流感以及其他动物的流感。近二十年 来，由于世界各地动物流感的暴发频率越来越高、流行面积越来越广，因而导致全球对它的 高度关注，虽然各国对动物流感防制策略不尽相同，但都把动物流感的快速诊断和及时监 测作为首要步骤。在国际贸易中，对动物流感的检疫也成为各国进出口贸易的重点检测对 象。动物流感检测方法包括传统动物流感检测方法和分子生物学检测方法。传统动物流感 检测方法主要有病毒分离培养和血清学诊断(如琼脂扩散实验、酶联免疫吸附实验、间接 血凝抑制实验及病毒中和试验等)，传统的动物流感检测方法不足之处在于操作繁琐、诊断 时间长、结果重复性不好等。特别是动物流感宿主和血清型众多，且新的变异株不断出现， 而制备血清型特异性单克隆抗体相对困难，近来研究发现，用鸡胚分离和培养的流感病毒 常出现宿主介导变异，所有这些都限制了传统方法在实际中的应用。目前新型的核酸扩增检测方法发展快速，由于其简便快捷，结果准确，已经在临床 检疫中广泛应用，取得了良好的效果，目前已有替代传统检测方法的趋势。尽管A型流感病毒M基因相对保守，但不同毒株特别是来源于不同感染宿主的A 型流感病毒，在M基因序列上存在明显差异。近期，锁核酸(locked nucleic acid,LNA)作 为一种新颖的核苷酸衍生物在生物学研究领域引起了人们的广泛关注，它是一种特殊的双 环状核苷酸衍生物，结构中含有一个或多个2' -0,4' -C-亚甲基-β-D-呋喃核糖核酸单 体，核糖的2' -0位和4' -C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚 甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖C3'-内型的N构型，降低了核糖结构的 柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。对DNA、RNA有很好的识别能力和强大的亲3和力。LNA和DNA、RNA互补的双链有很强的热稳定性(Δ Tm = 3 8°C )，具有抗3 ‘脱氧 核苷酸酶降解的稳定性，合成方法相对简单，部分或完全修饰的LNA寡核酸链可用氨基磷 酸法在DNA自动合成仪上合成。本研究为保证方法的通用性，保证探针的匹配性，我们在大 量序列分析基础上，在国内首次设计LNA修饰的短探针用于检测A型流感病毒，缩短了探针 的核苷酸数量，并提高了方法的灵敏度。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一组特异性强、灵敏度高的检测A型流感病毒核苷酸 序列，包括引物序列和基于LNA修饰的短探针序列。本专利技术的另一个目的是提供快速、准确、使用方便的基于LNA修饰的检测A型流感 病毒的通用检测试剂盒。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案选择A型流感病毒M基因编码区特定序列作为靶区域，在多重序列比对的基础上， 进行引物和探针设计。引物长度为20个碱基左右，GC含量为50% -60%，引物内无二级结 构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度(Tm值)相差小于5°C。探针 的长度在12 14个碱基左右，采用LNA修饰，并标记荧光基团。一组检测A型流感病毒的通用核苷酸序列，如下1)5，-CCRATC YTG TCA CCT CTGACTAA-3 ‘ (SEQ ID NO 1)2)5，-CGT CTA CGC TGC AGT CCT C_3，(SEQ ID NO 2)Y代表嘧啶，此处为T或C ;R代表嘌呤，此处为A或G ；3) 5，- [FAM] -CAC TGG GCA CGG JGA- [TAMRA 或 BHQ1] -3，(SEQ ID NO 3)其中序列1)和2)分别为检测A型流感病毒M基因的正义引物和反义引物，序 列3)为检测A型流感病毒M基因的LNA修饰的荧光短探针，用斜体表示的碱基用LNA 进行修饰，即第4、7、10、13位的碱基用LNA进行修饰，探针的5’端标记报告荧光基团 FAM(6-carboxy-荧光素)，3’端标记淬灭基团TAMRA或BHQl。我们采用TaqMan荧光RT-PCR检测技术建立了 A型流感病毒通用检测方法，对反 应的各种条件进行了优化，其中包括引物探针的筛选，Mg2+使用浓度的优化，引物探针浓度 的优化，得到以下试剂盒。检测A型流感病毒LNA修饰短探针检测试剂盒，由以下组分组成1)裂解液购自INVITR0GEN公司，按15ml/瓶进行分装，2瓶/盒。2)RT-PCR反应液，表1为反应液配方。 表IRT-PCR反应液配方组分终浓度5 X RT-缓冲液0.5 X RT-缓冲液10 X PCR缓冲液0.5 X PCR缓冲液本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组检测Ａ型流感病毒的核苷酸序列，其核苷酸序列如序列表ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１至ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３，其中序列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１和ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２分别为检测Ａ型流感病毒Ｍ基因的正义引物和反义引物，序列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３为检测Ａ型流感病毒Ｍ基因的ＬＮＡ修饰的荧光探针。

【技术特征摘要】
一组检测A型流感病毒的核苷酸序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1至SEQ ID NO3，其中序列SEQ ID NO1和SEQ ID NO2分别为检测A型流感病毒M基因的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO3为检测A型流感病毒M基因的LNA修饰的荧光探针。2.根据权利要求1所述的检测A型流感病毒的核苷酸序列，其特征在于所述探针序 列SEQ ID NO 3的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA或BHQ1，第 4、7、10、13位的碱基用LNA进行修饰。3.一种检测A型流感病毒的试剂盒，由以下组分组成1)裂解液；2)RT-PCR反应液，包括PCR缓冲液、RT缓冲液、MgCL2, dNTP、正义引物、反义引物和荧 光探针；3)RT-PCR酶颗粒；4)Taq DNA聚合酶；5)DEPC 水；6)阴性对照流感病毒阴性组织样品，用0.01mol/L p...

【专利技术属性】
技术研发人员：张鹤晓，高志强，乔彩霞，蒲静，谷强，张伟，刘环，张利峰，汪琳，柏亚铎，张向东，
申请(专利权)人：中华人民共和国北京出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]