血浆抗坏血酸盐的清除方法技术

本发明专利技术研究了能重新合成抗坏血酸盐的小鼠体内抗坏血酸盐含量的人工调节。当给小鼠服用外源性的抗坏血酸盐或其生理性前体Ｌ－古洛糖酸－γ－内酯时，小鼠体内抗坏血酸盐的血浆含量显著上升，但很快又恢复到初始水平。相反，给小鼠服用抗坏血酸盐氧化酶会引起抗坏血酸盐的迅速消失，但很快又恢复。这些结果表明调节动物体内的抗坏血酸盐含量有困难。然而，经甲氧基聚乙二醇化学修饰后可成功地延长动物体内外源性抗坏血酸盐氧化酶的循环寿命。与天然酶相比，经修饰的酶保留了全部活性，并能表现出显著的长时间的血浆抗坏血酸盐清除作用。这一研究表明，经化学修饰的抗坏血酸盐氧化酶在抗坏血酸盐的动物研究中该有很多用途，因为人们发现，该抗坏血酸盐氧化酶甚至可以清除能在体内合成抗坏血酸盐的动物中的抗坏血酸盐，而无须饮食控制。因为小鼠和人的肿瘤系统受抗坏血酸盐含量调节的影响，所以这类酶被证实可用于肿瘤控制。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及利用生物惰性聚合物修饰的抗坏血酸盐氧化酶有效地清除血浆抗坏血酸盐的方法。现有技术<综述白血病前期(骨髓增生异常综合症，MDS)和急性髓细胞样白血病(AML)患者对L-抗坏血酸(LAA)体内调节的需求>体外克隆检测发现，L-抗坏血酸是小鼠骨髓瘤细胞生长的必备条件(1)。这一发现同样适用于人的骨髓瘤的生长，虽然这种作用很难检测；因为人的骨髓瘤细胞难于在体外生长(2)。人的急性髓细胞样白血病细胞克隆在我们每日加液培养的琼脂培养基上生长良好(3)，而早期对少数患者的研究表明，大约一半患者的白血病细胞生长受L-抗坏血酸的调节(4)。这一发现已在大量患者中得到证实。综合考虑上述发现，我们认为在体外对L-抗坏血酸敏感的白血病细胞可能受L-抗坏血酸体内调节的影响。此前的研究大多是关于L-抗坏血酸对急性髓细胞样白血病细胞在体外的影响。最近的研究表明，通常被认为和急性髓细胞样白血病有关的白血病前期，即骨髓增生异常综合症，在对L-抗坏血酸的敏感性方面实际上具有相同的表现L-抗坏血酸使30％的受试者的细胞生长得到促进，而16％的受试者的细胞生长受到了抑制(5)。<最近的研究结果来自接受L-抗坏血酸体内调节的一个患者和另一个组的大量患者补充L-抗坏血酸的病例>利用上述信息，对于那些L-抗坏血酸促进了体内白血病细胞生长的患者，临床上直接的方法自然是清除体内的L-抗坏血酸。IRB(国际观察组，International Review Board)核准的清除L-抗坏血酸的草案中记载了一位患者，通过清除L-抗坏血酸实际上延缓了该患者白血病的复发。然而，该患者的病最终还是复发了，表现为外周血肿瘤细胞计数开始迅速增加。于是，除了逐渐增加L-抗坏血酸的剂量以期加强效果之外别无选择，这样可以抑制发病10周以上。<由上述理论和经验所得到的推论致使人们循环使用两种截然相反的方法，即过度的补充和过度的清除>令人信服的是，事实上大剂量的L-抗坏血酸能抑制人的恶性肿瘤。人们还相信，在上述病例中，清除L-抗坏血酸是有益的，它延长了明显复发的时期(12周)，这是由L-抗坏血酸可促进患者白血病细胞生长这一事实得出的合乎逻辑的结果。这种截然相反的结果在人类恶性肿瘤的治疗中并非没有先例。实际上，通常认为L-抗坏血酸是一种抗氧化剂，但它也能至少在体外转变为另一种截然相反的物质——促氧化剂(6，7)，这有赖于例如其周围的金属离子浓度(8)。这是对这种两极活性的一种可能的解释。L-抗坏血酸的极度缺乏很可能使得细胞失去抗氧化剂的保护，而内源性的无处不在的氧化剂就可以损害毫无保护能力的细胞。在细胞的某些内/外状况(又，例如存在Fe++)下，极高含量的L-抗坏血酸可产生促氧化剂，从而损伤细胞。无论其机理如何，扩展到大剂量的剂量反应研究证实，L-抗坏血酸对该第一位患者的白血病细胞生长具有截然相反的抑制作用。
技术实现思路
很清楚，抗坏血酸盐可对人类的许多生理过程产生作用。抗坏血酸盐的摄入量不足会引起与胶原蛋白合成减少有关的坏血病。抗坏血酸影响伤口愈合、胃对铁的吸收及许多免疫反应和生化反应。很显然，抗坏血酸盐的大多数功能，如果不是全部的话，都与其还原性有关，这种还原性使金属离子保持在还原态。作为还原剂，抗坏血酸盐在水性环境中既可作抗氧化剂又可作促氧化剂。然而，在很多体外研究结果的基础上，通常将抗坏血酸盐作为人的一种重要的抗氧化剂。此外，人们普遍认为抗坏血酸盐有助于阻止与氧化损伤有关的病理过程，但在这方面只有些间接证据。还有资料显示，抗坏血酸盐会影响动物细胞的体外生长。根据细胞的不同，这种影响可以是促进，也可以是抑制。虽然抗坏血酸盐影响生长的确切机理还不清楚，但已证明这种作用是生物的而不是物理化学的，因为抗坏血酸盐的光学异构体或其它氧化还原化合物没有这种作用。而且，值得一提的是，恶性肿瘤细胞比正常细胞对抗坏血酸盐的作用更敏感。我们已发现急性髓细胞样白血病和骨髓增生异常综合症患者的恶性肿瘤细胞对抗坏血酸盐有异乎寻常的敏感性。这种体外作用可转化到体内，最终起到抑制肿瘤的作用，对此已有令人信服的证据。正如现有技术描述中所充分论述的，过度的清除和过度的补充都会有利于癌瘤的控制。所以补充过程和清除过程需循环进行。进一步讲，需要在补充周期开始前使清除周期达到最大效果，反之亦然。在这两种极端措施的应用过程中，清除是目的。为了证明抗坏血酸盐的诸多推测的功能之间的生理相关性，动物试验是必不可少的。为了实验的目的，需要人工调节动物体内的抗坏血酸盐的含量，但饮食控制不容易做到这一点。服用过量的抗坏血酸盐容易从身体中排泄掉，且只有一少部分用以均衡体内抗坏血酸盐的储备。而且，诸如小鼠等实验动物能内源性地合成抗坏血酸盐，并且它们生来对饮食摄入的抗坏血酸盐不敏感。动物试验对于研究与肿瘤控制有关的抗坏血酸盐的调节十分重要，而小鼠是非常有用的实验动物，这两方面的因素促使我们去研究小鼠体内抗坏血酸盐调节的新方法。本专利技术试验了两种相反的方法，一种方法提高了抗坏血酸盐的含量，另一种方法是选择性地清除抗坏血酸盐。附图简述结合附图，通过以下的详述将会更清楚地理解本专利技术的上述及其他目的、特点及其他优点，其中附图说明图1.施用了抗坏血酸钠(-o-)和L-古洛糖酸-γ-内酯(-·-)的小鼠体内血浆抗坏血酸盐含量随时间的变化。用蒸馏水溶解药物，腹膜内注射给药，剂量均为5mmole/kg。根据《材料和方法》中所述的方法，按时间顺序从每只动物取血，用HPLC-ECD(高效液相色谱-电化学检测器)进行血浆抗坏血酸盐检测。零时间对照组动物注射0.2ml生理盐水。数据以均数±标准差表示(n＝3-5)。图2.外源性抗坏血酸盐氧化酶对小鼠血浆抗坏血酸盐含量的影响。用生理盐水溶解抗坏血酸盐氧化酶，以不同剂量给BABL/c小鼠静脉注射给药。对照组动物注射0.1ml生理盐水。用药后一小时检测血浆抗坏血酸盐含量。小插图显示施用了剂量为400单位/kg抗坏血酸盐氧化酶的小鼠体内血浆抗坏血酸盐含量随时间的变化。数据以均数±标准差表示(n＝3-5)。图3.经修饰的抗坏血酸盐氧化酶和未经修饰的抗坏血酸盐氧化酶的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。用6％的凝胶作电泳，用考马斯蓝作蛋白染色。I泳道，是与甲氧基聚乙二醇(mPEG)结合的抗坏血酸盐氧化酶；II泳道，是抗坏血酸盐氧化酶；III泳道，是标准分子量的标记物，该标记物由肌凝蛋白H链(200kDa)、磷酸化酶(111kDa)、牛血清蛋白(73kDa)和卵白蛋白(47kDa)组成。图4.施用了天然的抗坏血酸盐氧化酶的小鼠(-o-)和施用了与甲氧基聚乙二醇结合的抗坏血酸盐氧化酶的小鼠(-·-)体内抗坏血酸盐清除的对比。生理盐水溶解药物，腹膜内注射给药，剂量均为400单位/kg。对照组动物注射0.1ml生理盐水。数据以均数±标准差表示(n＝3-5)。本专利技术的实施方式材料和方法本专利技术所用材料如下抗坏血酸钠，L-古洛糖酸-γ-内酯，抗坏血酸盐氧化酶(来自CurcubitaSpecies)，由氰尿酰氯(平均分子量为5000)活化的甲氧基聚乙二醇，四硼酸钠，枸橼酸钠，偏磷酸和二硫苏糖醇，上述制剂本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在癌症治疗中清除血浆抗坏血酸盐的方法，该方法采用了生物惰性聚合物修饰的抗坏血酸盐氧化酶。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：朴赞亨，勇C卜，
申请(专利权)人：进洋制药株式会社，朴赞亨，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]