体内胚胎干细胞转染法建立转基因动物或乳腺生物反应器制造技术

本发明专利技术涉及用于建立转基因动物或乳腺生物反应器，特别是体内胚胎干细胞转染法建立转基因动物或乳腺生物反应器。其特征在于将配制好的转染源，直接引入到动物ＥＳＣ发育所在的部位，使ＥＳＣ带上转染源，以ＥＳＣ为载体，转染源被带入到胚胎体内。本发明专利技术具有简单易行，成本低，可提高转基因动物建成的效率，缩短生产周期，降低生产成本等优点。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

Establishment of transgenic animal or mammary gland bioreactor by in vivo transfection of embryonic stem cells

The present invention relates to the establishment of transgenic animal or mammary gland bioreactor, especially in vivo embryonic stem cell transfection method to establish transgenic animal or mammary gland bioreactor. The utility model is characterized in that the prepared transfection source is directly introduced into the place where the animal ESC is developed, and the ESC can be transfected with the ESC source. The invention has the advantages of simple and easy operation, low cost, high efficiency of the transgenic animal, shortening the production cycle, reducing production cost, etc..

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及用于建立转基因动物或乳腺生物反应器，特别是体内胚胎干细胞转染法建立转基因动物或乳腺生物反应器。自从1980年第一只转基因小鼠诞生以来，转基因动物技术已得到了很大的发展，目前已建成的转基因哺乳动物除小鼠外，还有大鼠、兔、猪、羊、牛等。随着分子生物学技术的飞速发展，建立转基因动物的上游技术，如载体的构建、外源基因的改造等基因操作技术的不断改进，使得转基因动物技术在组织的特异性表达和基因在动物整体水平上的功能研究方面得到了很大的发展，为基因的功能研究提供了良好的技术平台，在高科技制药等科技开发领域也展示出良好的应用前景。然而目前建立转基因动物的主要方法仍然是受精卵显微注射法。虽然受精卵前核的显微注射技术在不断的提高，设备也在不断地改善，但其基本的技术路线并无新的突破，人们不得不承认，显微注射法使转基因动物的建立受到了很大的限制。其主要问题是，设备昂贵，技术要求高，难度大，实验周期长等，在采集受精卵时仍然沿用的是“杀鸡取卵”的办法，这在小动物尚可被接受，如用于大动物，尤其是用于工业化生产时，费用相当可观，令人望而却步。另外在哺乳动物只有小鼠的受精卵前核是透明可见的，其他动物的受精卵因卵黄较多或含有脂滴，使前核部位出现不同程度的浑浊，使得基因的注入带有很大的盲目性，这也是目前转基因技术用于大动物的成功率远低于小鼠的主要原因之一。人们也曾尝试过许多其他的办法，如精子载体法、病毒载体法和胚胎干细胞介导法，但都因存在的问题较多至今没有得到普遍的应用。胚胎干细胞(Embryonic stem cells，ESC)是从着床前的动物胚胎中分离获得的一种多功能胚胎干细胞，主要包括内细胞群和桑葚胚的细胞；将ESC注入到动物的囊胚后可参与宿主胚胎的构成，形成嵌合体，直至达到种系嵌合。因此，可将ESC作为一种载体，把外源基因导入个体，从而获得转基因动物。通过ESC途径获得转基因动物的方法在发育生物学、遗传学以及功能基因组学等领域得到了较为广泛的应用，然而这些应用也仅限于小鼠的研究，因目前只有小鼠的ESC已经建系。ESC的分离、纯化技术难度大，尤其是要保持其在体外的未分化状态需要苛刻的条件和昂贵的试剂。但由于ESC介导法是一条极具魅力的建立转基因动物的技术路线，人们急切的寻找着新的方法，以期ESC介导法在转基因动物的研究中起到应有的作用。尤其是转基因动物的应用走向产业化，需要在大动物身上进行生产和实验。利用体内ESC转染法更适合于大动物，以便提高制备转基因动物的成功率和降低成本。为此，近年来国外学者投入了大量的资金和精力来建立各种动物的ESC系。但一直没有突破性进展。人们期待着一种能更好地利用ESC的方法的诞生。这种方法将带来巨大的社会效益和经济效益。本专利技术的目的就是针对上述现有技术的不足之处，提供一种简单易行，成本低，可提高转基因动物建成的效率，缩短生产周期，降低生产成本的体内胚胎干细胞转染法建立转基因动物或乳腺生物反应器。本专利技术的目的是这样实现的一种体内胚胎干细胞转染法建立转基因动物或乳腺生物反应器，其特征在于将配制好的转染液，直接引入到动物ESC发育所在的部位，使得ESC带上转染源，以ESC为载体，将转染源带入到胚胎体内。本专利技术的目的还可以这样实现将配制好的转染源通过注射器直接注射到动物ESC发育所在的部位中。所述的转染源的引入时间是在动物受精后的a、第2天完成 b、第3天完成；c、第4天完成d、第5天完成；e、第6天完成。所述转染源的主要组成成份是a、目的基因的重组质粒；b、阳离子脂质体；c、细胞培养基。所述转染源的各成份为a、目的基因的重组质粒0.3％～1.0％；b、阳离子脂质体1.0％～10％；c、细胞培养基适量。所述的目的基因的重组质粒包括WAP-PA，LSI-PA，WAP-GFP，改良奶质，珍贵蛋白等等。所述的细胞培养基含有1640，DMEM，MEM等等。本专利技术的目的也还可以这样实现将配制好的转染源通过导管导入到动物ESC发育所在的部位中。所述的转染源的引入时间是在动物受精后的a、第2天完成；b、第3天完成；c、第4天完成；d、第5天完成；e、第6天完成。所述转染源的主要组成成份是a、目的基因的重组质粒；b、阳离子脂质体；c、细胞培养基。所述转染源的各成份为a、目的基因的重组质粒0.3％～1.0％；b、阳离子脂质体1.0％～10％；c、细胞培养基适量。所述的目的基因的重组质粒包括WAP-PA，LSI-PA，WAP-GFP，改良奶质，珍贵蛋白等等。所述的细胞培养基含有1640，DMEM，MEM等等。下面将结合实施例对本专利技术的方法作进一步的详述操作前需将动物麻醉，再将导管通过雌性动物的阴道插入到子宫底，近输卵管处，引入转染源，通过调整动物的体位并配合适当的手法，使转染源与桑葚胚或囊配中的ESC充分接触，转染源得以引入到ESC中，参与胚胎的发育。也可通过腹腔镜或外科手术的方法，将导管或针头置入到输卵管的伞部或壶腹部，使转染源引入到ESC所在的部位，从而建立转基因动物。随着胚胎发育至胎儿出生，经检测，如新生动物的基因组内带有外源基因(即转染源)，这只动物便是转基因动物的首建者，如这只动物的子一代动物的基因组中仍带有该外源基因，便建立了一个新的转基因动物的品系。实施例1.以小鼠作为转基因的动物。事先配制好含有外源基因的转染液，转染源可以是目的蛋白的cDNA或是基因组DAN，如tPA、EPO、SOD和TPO等，也可以是用于实验目的的报告基因，如pCX-EGFP探针或lacZ基因探针等。转染液中还应含有一定量的促转染剂，如脂质体、磷酸钙等。选择小鼠交配后的第3、4、5天进行转染。操作前将小鼠麻醉，用直径1.5-2毫米左右的塑料管或硬硅胶管，经过雌鼠的阴道插入到子宫和输卵管部位，注入转染液，待小鼠出生后，进行检测，基因组中携带有外源基因者即为转基因动物的首建者。实施例2以家兔作为转基因的动物。此时所需的条件方法和要求基本上与小鼠的相同，只是所用的注射器相对要大，插管用的软导管相对要长，略粗，注入的转染液要多，一般需要6-10ml。为了转染液注入的部位更加准确，也可通过外科手术的方法，将转染液直接打入到输卵管中并进入到子宫腔内，从而提高基因转染的阳性率。实施例3以牛或羊作为转基因的动物。此时最能发挥该方法的优越性，目前人工饲养的用于生产牛奶或羊奶的奶牛和奶山羊多是通过人工受精的方法来繁殖的，本方法所采用的是与人工受精类似的方法，所不同的是人工受精注入的是动物的精液，而该方法则注入的是含有外源基因的转染液，人工受精是在动物的排卵期，而转染液注入的时间则是在人工受精的第4、5、6天。方法更为方便可行。如转染的外源基因是含有目的基因的乳腺特异性表达载体构建，则建成的转基因动物的乳汁中就会含有tPA、EPO、SOD或TPO等贵重的要用蛋白。也可以用该方法来改善奶的品质，如提高钙的含量、提高其人体易于吸收的营养成分等。国外已有生产含乳铁蛋白奶的转基因牛，用这种牛奶制成的营养奶粉每年可销售50亿美元。本专利技术相比现有技术具有如下优点简单易行，可提高转基因动物建成的效率，缩短生产周期，降低生产成本。又因这种应用体内ESC携带外源基因的方法克服了目前ESC分离、纯化和培养的困难，可以使得ESC携带外源基因制备大型转基因动物，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种体内胚胎干细胞转染法建立转基因动物或乳腺生物反应器，其特征在于将配制好的转染源，直接引入到动物ＥＳＣ发育所在的部位，使ＥＳＣ带上转染源，以ＥＳＣ为载体，转染源被带入到胚胎体内。

【技术特征摘要】
1.一种体内胚胎干细胞转染法建立转基因动物或乳腺生物反应器，其特征在于将配制好的转染源，直接引入到动物ESC发育所在的部位，使ESC带上转染源，以ESC为载体，转染源被带入到胚胎体内。2.根据权利要求1所述的体内胚胎干细胞转染法建立转基因动物或乳腺生物反应器，其特征在于所述的转染源通过注射器直接注射到动物ESC发育所在的部位中。3.根据权利要求1所述的体内胚胎干细胞转染法建立转基因动物或乳腺生物反应器，其特征在于所述的转染源通过导管导入到动物ESC发育所在的部位中。4.根据权利要求1所述的体内胚胎干细胞转染法建立转基因动物或乳腺生物反应器，其特征在于所述的转染源的引入时间是在动物受精后的a、第2天完成；b、第3天完成；c、第4天完成；d、第5天完成；e、第6天完成。5.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：安靓，
申请(专利权)人：安靓，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]