促肾上腺皮质素释放因子受体-2缺陷型小鼠及其用途制造技术

本发明专利技术提供了促肾上腺皮质素释放因子受体２缺陷的转基因小鼠。ＣＲＦＲ２突变小鼠对应激有超敏性，并表现出焦虑样行为增加。突变小鼠具有正常的基础摄食和体重增加，但在停止给予食物后表现出摄食减少。静脉内给予ＵＣＮ对该突变小鼠没有作用，但能降低正常动物的动脉压。ＣＲＦＲ２的缺陷导致动眼神经副核的嘴侧中的尿皮质素ｍＲＮＡ显著增加，扁桃体中央核中的ＣＲＦ ｍＲＮＡ显著增加。这些结果证明与ＣＲＦＲ１突变小鼠相反，ＣＲＦＲ２突变小鼠对应激的敏感性增加并表现出焦虑样行为。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

Corticotropin releasing factor receptor -2 deficient mice and uses thereof

The present invention provides transgenic mice deficient in corticotropin releasing factor receptor 2. CRFR2 mutant mice showed high sensitivity to stress and increased anxiety like behavior. The mutant mice had normal basal feeding and body weight gain, but showed reduced feeding after cessation of feeding. Intravenous administration of UCN had no effect on the mutant mice, but reduced the arterial pressure in normal animals. The defect of CRFR2 leads to a marked increase in mRNA in the rostral portion of the nucleus of the oculomotor nerve, and a significant increase in CRFmRNA in the amygdala. These results demonstrate that, in contrast to CRFR1 mutant mice, the CRFR2 mutant mice showed increased sensitivity to stress and exhibited anxiety like behavior.

【技术实现步骤摘要】
本专利技术主要涉及神经生物学、内分泌学和精神病学领域。更具体地，本专利技术涉及对焦虑和促肾上腺皮质素释放因子受体-2缺陷型小鼠的研究。相关领域描述促肾上腺皮质素释放因子(CRF)是下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴的关键性的协调剂。在对应力的应答中，下丘脑室旁核(PVN)释放的促肾上腺皮质素释放因子激活垂体前叶的促皮质激素细胞上的促肾上腺皮质素释放因子受体，导致将促肾上腺皮质素(ACTH)释放到血流中。AVTH进而激活肾上腺皮质中的ACTH受体而增加糖皮质激素的合成和释放(1)。CRFR1和CRFR2(CRF的受体)遍布于CNS及外周组织。虽然CRF对CRFR1的亲和力比对CRFR2的亲和力高，但认为尿皮质素(urocortin)(一种UCN)(CRF相关肽)是CRFR2的内源性配体，因为它比CRF的亲和力几乎高40倍(2)。CRFR1和CRFR2有约71％氨基酸序列类似，且它们在脑和外周组织中定位不同(3-6)。CRFR1主要在垂体、皮质、小脑、菱脑和嗅球中表达，而CRFR2见于中隔旁侧、下丘脑室内侧(VMH)、脉络丛和许多外周部位(5，7，8)。CRFR2有一些同种型，其中有一种显示不结合任何已知配体(9)。CRFR1缺陷型小鼠具有降低的HPA轴激素水平、对损伤的应激反应和降低的焦虑样表现(10，11)。这些结果与体内用CRFR1特异性拮抗剂得到的那些结果相一致(12-14)。相反，CRFR2特异性拮抗剂最近还没有获得，因为从其1995年克隆以来，对CRFR2的生理功能几乎没有多少阐明。UCN可能是CRFR2的内源性配体，并显示出当中枢进食时是给药的调节剂(15)。因为CRFR2位于下丘脑室内侧(摄食调节和腹饱满的中心位置)，尿皮质素对这些受体的作用可能影响摄食。另外，外周给予尿皮质素会导致低血压(2，16)，这可能是由于CRFR2在血管系统中的作用引起的(5，8)。现有技术的不足是缺少促肾上腺皮质素释放因子受体-2缺陷型小鼠。本专利技术满足了本领域中这一长期存在的需要和愿望。专利技术概述为了剖析CRFR2的发育和生理作用，本专利技术制备了CRFR2突变裸鼠并对其进行分析。CRFR2缺陷型小鼠表现出增加的焦虑样行为和对应激反应的超敏性HPA轴。CRFR1和CRFR2突变小鼠了提供焦虑和抑郁的有价值的模型，并能进一步帮助说明这些疾病的分子机理。对促肾上腺皮质素释放因子信号途径及其在焦虑和抑郁控制中的作用的研究，可能为有效治疗这些疾病提供必需的线索。因此，本专利技术涉及在至少一个促肾上腺皮质素释放因子受体2(CRFR2)的等位基因被破坏的一种非天然性转基因小鼠，所述的小鼠不能从所述的等位基因表达促肾上腺皮质素释放因子受体2蛋白质。较佳地，所述的促肾上腺皮质素释放因子受体2等位基因的外显子10、11和12的DNA序列已缺失。可用新霉素抗性基因盒置换转基因小鼠的这些DNA序列。这种转基因小鼠对此种置换可以是杂合性或纯合性小鼠。在本专利技术的实施例中还包括本专利技术小鼠与另一品系小鼠之间交配的后代。本专利技术的另一实施例是将CRFR2缺陷型小鼠运用于研究焦虑或抑郁并测试某化合物对焦虑和抑郁的作用。例如，提供一种筛选具有焦虑调节活性的化合物的方法，所述的方法包括a)将所述的化合物给予本专利技术的转基因小鼠；b)测试所述小鼠的焦虑相关行为；和c)比较所述小鼠与本专利技术另一种转基因小鼠(未给予所述的化合物)的焦虑样行为。另外，还提供了一种筛选具有抑郁调节活性的化合物的方法，所述的方法包括如下步骤a)将所述的化合物给予本专利技术的转基因小鼠；b)测试小鼠的抑郁相关行为；和c)比较所述小鼠与本专利技术的另一种转基因小鼠(未给予所述化合物)的抑郁样行为。本专利技术的另一实施例中包括以类似的流程用CRFR2缺陷型小鼠筛选能影响血压或血管生成的化合物。本专利技术的另一实施例是将CRFR2缺陷型小鼠运用于对PHA轴的生理学研究，如一种筛选对下丘脑-垂体-肾上腺轴应激反应有影响的化合物的方法，其包括如下步骤a)将所述的化合物给予本专利技术的转基因小鼠；b)将所述的小鼠置于诱导应激的条件中；c)监测所述小鼠的皮质酮和促肾上腺皮质激素的血浆水平；和d)将所述的水平与未被置于所述诱导应激条件中的本专利技术的转基因小鼠的相比较。在本专利技术的另一实施例中，通过监测促肾上腺皮质素和ACTH的血浆水平，可用此小鼠来研究某化合物对HPA轴对应激反应的影响。本专利技术的另一实施例涉及用本专利技术的小鼠来研究促肾上腺皮质素释放因子受体2对其它蛋白质如促肾上腺皮质素释放因子和尿皮质素的影响。在本专利技术的另一实施例中，用CRFR2缺陷型小鼠来检验CRFR1的反应不受存在CRFR2的妨碍。本专利技术的另一实施例是对CRFR2刺激或抑制血管生成活性的调控。附图简述通过参见本申请中包括的附图的某些实施例可以更详细地了解本专利技术上述的特征，优点和目的也会更清楚。这些图是说明书的一个组成部分。需要指出的是，附图是用来说明本专利技术的优选实施例的，不能视为对本专利技术范围的限制。附图说明图1A-1E显示了产生CRFR2-缺陷型小鼠、对突变小鼠及其中影响检测所用的流程。图1A是CRFR2基因的基因组结构图示，显示编码第5跨膜区域到第7跨膜区域末端的一半的外显子10、11和12的缺失。还显示了用于同源重组的靶构建物。在图1B中，通过Southern印迹分析分离自野生型(+/+)、杂合型(+/-)和裸突变(-/-)小鼠分离的尾部DNA，检测到被破坏的等位基因。图1C显示了在CRFR2对照(上部)和突变(下部)小鼠中，125I-蛙皮降压肽结合的放射自显影的结果。注意，在CRFR2突变小鼠中隔旁侧中没有CRFR2结合，而CRFR1皮质结合与对照小鼠的类似。图1D显示了用苏木精和曙红(H&E)染色的肾上腺。注意10X放大倍数显示的肾上腺尺寸(上图)或20X放大倍数显示的结构(下图)没有差异，C，皮质；M，髓质；ZG，球状带；ZF，束状带；ZR，网状带；n＝8。图1E显示垂体的H&E染色，是固定在肝上进行组织切片(上图)(4X放大倍数)，n＝8。10X放大倍数，用抗-ACTH抗体(20)(下图)鉴定垂体促皮质激素细胞，n＝5，P，后叶，I，中叶；A，前叶。垂体或促皮质激素细胞定位或ACTH的表达水平没有观察到解剖学差异。图2A-2D显示了突变动物中HPA轴对应激的超敏性。*＝相同时间点与野生型对照有显著性差异，p＜0.01(Scheffe-后hoc检验)。用未麻醉的眼眶后眼睛放血得到血浆。图2A显示了在700AM受应激前ACTH的血浆水平，n＝16。图2B显示了700AM和500PM时的皮质酮血浆基础水平，n＝7。图2C显示了约束应激对ACTH作用的时间过程。图2D显示了突变裸鼠在700AM时的皮质酮血浆水平与相同时间点的野生型对照存在显著性差异，n＝7。图3A-3B显示了停止野生型和突变型同窝鼠仔摄食24小时的影响。图3A显示，用Scheffe后-hoc检验，与野生型一窝鼠仔相比，基础摄食和停止摄食24小时后突变型小鼠的食物消耗情况(n＝10)，p＜0.001。图3B显示了野生型和突变型小鼠的重量，基础(白色柱)重量和停止摄食后再喂食24小时后的重量(黑色柱)。注意组间基础体重或再喂食后体重间没有显著性差异。图4A-4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种非天然的转基因小鼠，其特征在于，所述小鼠有至少一个促肾上腺皮质素释放因子受体２（ＣＲＦＲ２）的等位基因被破坏，导致所述小鼠不表达所述等位基因的促肾上腺皮质素释放因子受体２蛋白质。

【技术特征摘要】
US 1999-7-15 60/144,2611.一种非天然的转基因小鼠，其特征在于，所述小鼠有至少一个促肾上腺皮质素释放因子受体2(CRFR2)的等位基因被破坏，导致所述小鼠不表达所述等位基因的促肾上腺皮质素释放因子受体2蛋白质。2.如权利要求1所述的转基因小鼠，其特征在于，所述促肾上腺皮质素释放因子受体2等位基因的外显子10、11和12的DNA序列缺失。3.如权利要求2所述的转基因小鼠，其特征在于，所述的DNA序列被新霉素抗性基因盒置换。4.如权利要求3所述的转基因小鼠，其特征在于，所述小鼠对所述的置换是杂合性小鼠。5.如权利要求3所述的转基因小鼠，其特征在于，所述小鼠对所述的置换是纯合性小鼠。6.权利要求3所述的小鼠与另一品系小鼠之间交配的后代。7.一种筛选具有焦虑调节活性的化合物的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤a)将所述的化合物给予权利要求5所述的转基因小鼠；b)测试所述小鼠的抑郁相关行为；c)将所述小鼠的焦虑样行为与未给予所述化合物的权利要求5所述的另一种转基因小鼠的焦虑样行为。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，用选自以下的方案测试所述小鼠的焦虑上升的加号迷宫、明/暗盒和旷场测试。9.一种筛选具有抑郁调节活性的化合物的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤a)将所述的化合物给予权利要求5所述的转基因小鼠；b)测试所述小鼠的抑郁样行为；c)将所述小鼠的抑郁样行为与未给予所述化合物的权利要求5所述的另一种转基因小鼠的抑郁样行为作比较。10.一种筛选能控制血压的化合物的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤a)将所述的化合物给予权利要求5所述的转基因小鼠；b)测试所述的小鼠的血压变化；c)将所述的小鼠的血压变化与另一种小鼠的血压变化相比较，其中所述的另一种小鼠选自未给予所述化合物的权利要求5所述的转基因小鼠和给予所述化合物的野生型小鼠。11.一...

【专利技术属性】
技术研发人员：李国芬，TL贝尔，GW史密斯，W韦尔，
申请(专利权)人：研究发展基金会，
类型：发明
国别省市：US[美国]