本发明专利技术公开了一种β２微球蛋白与绿色荧光蛋白的融合蛋白，其氨基酸序列包括与ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１所示序列具有至少８５％相同性的第一区和与ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２所示序列具有至少８５％相同性的第二区；还公开了编码该融合蛋白的基因，含有该基因的重组表达载体，利用该重组表达载体制备该融合蛋白的方法，以及应用该融合蛋白检测抗原肽与ＭＨＣ－Ｉ类分子的亲和力的方法；该检测方法操作简便快速，结果准确可靠，鉴定效率高，成本低，适用于大通量的ＣＴＬ表位鉴定，具有良好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种融合蛋白，特别涉及一种P2微球蛋白与绿色荧光蛋白的融合蛋白，还涉及该融合蛋白的制备方法和应用。
技术介绍
细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte， CTL )表位是蛋白抗原经抗原递呈细胞(Antigen process cell, APC )加工处理，继而与主要组织相容性复合体-1 ( MHC-I)类分子结合并最终递呈给T细胞受体(T cell receptor, TCR)识别，引起有效免疫应答的短肽， 一般为8 10个氨基酸。CTL表位鉴定一直是免疫学的热点，是基于表位进行免疫诊断、免疫治疗和疫苗开发的关键。既往C1X表位養定主要采用先合成大量的序列错位重复肽，再通过淋巴细胞实验进行筛选的方法，不仅费时费力，花费大，而且鉴定效率低。MHC-I类分子属于跨膜糖蛋白，由重链和轻链以非共价键结合而成，轻链即为P2微球蛋白(p2M)。既往研究表明，MHC-I类分子重链可与外源性p2M及外源性抗原表位肽结合，且P2M可促进MHC-I类分子重链与抗原表位肽的结合。绿色荧光蛋白(ZsGreen)具有自发绿色荧光等特性，在分子生物学和细胞生物学领域得到广泛应用。
技术实现思路
有鉴于此，为克服现有CTL表位鉴定方法存在的不足，本专利技术的目的之一在于提供一种P2微球蛋白与绿色荧光蛋白的融合蛋白(p2M-ZsGreen),其氨基酸序列包括与SEQ IDNo.l所示序列具有至少85°/。相同性的第一区和与SEQIDNo.2所示序列具有至少85%相同性的第二区。进一步，其氨基酸序列包括如SEQIDNo.l所示的第一区和如SEQIDNo.2所示的第二区；进一步，所述第一区的羧基端与第二区的氨基端连接；进一步，所述第一区与第二区通过连接肽连接，所述连接肽具有如SEQIDNo.3所示的氨基酸序列。本专利技术的目的之二在于提供编码所述融合蛋白p2M-ZsGreen的基因。进一步，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。本专利技术的目的之三在于提供含有所述基因的重组表达载体。本专利技术的目的之四在于提供一种制备所述融合蛋白(32M-ZsGreen的方法，包括以下步骤a、 融合蛋白的表达取293FT细胞，用含有小牛血清的DMEM高糖培养液，在温度37。C、 C02气体浓度为50mL/m3的条件下培养过夜，待细胞密度达到60 ~ 70%时，加入重组表达载体FUp2MZsGreenGGGS进行转染，转染7 ~ 12小时后更换培养液，继续培养36~60小时后弃上清，收集细胞，用含有蛋白酶抑制剂的NPI-10緩冲液重悬，超声裂解细胞，离心，收集上清液；b、 融合蛋白的纯化采用Ni-NTA亲和层析柱纯化融合蛋白层析柱用NPI-10緩沖液清洗后，加入步骤a收集的上清液，先用NPI-20緩冲液清洗去除杂蛋白，再用NPI-MO緩冲液洗脱获得融合蛋白，收集洗脱液，用PBS在温度4。C条件下透析脱盐，再用聚乙二醇在温度4。C条件下浓缩，浓缩的融合蛋白溶液测定浓度后，置温度4。C保存，备用。本专利技术的目的之五在于提供所述融合蛋白P2M-ZsGreen在制备抗原肽与MHC-I类分子的亲和力检测试剂中的应用。本专利技术的目的之六在于提供应用所述融合蛋白p2M-ZsGreen检测抗原肽与MHC-I类分子的亲和力的方法，包括以下步骤将T2细胞接种于培养板中，加5入抗原肽和融合蛋白卩2M-ZsGreen,在温度37。C、 C02气体浓度为50 mL/m3的 条件下培养15 24小时，收集细胞培养液，离心弃上清，洗涤、封闭、固定细 胞后，用流式细胞术检测绿色荧光蛋白标记的T2细胞的比例。本专利技术的有益效果在于本专利技术运用分子克隆技术，成功构建了融合蛋白 (32M-ZsGreen的重组表达载体，并成功表达、纯化获得了融合蛋白p2M-ZsGreen， 将所得融合蛋白p2M-ZsGreen作为检测试剂，应用于抗原肽与MHC-I类分子的 亲和力检测实验中，成功进行了 CTL表位鉴定；利用融合蛋白(32M-ZsGreen检 测抗原肽与MHC-I类分子的亲和力的方法操作简便快速，结果准确可靠，鉴定 效率高，成本低，适用于大通量的CTL表位鉴定，具有良好的应用前景。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发 明作进一步的详细描述，其中图1为p2M的聚合酶链式反应.(PCR)产物的琼脂糖凝胶电泳图2为重组表达载体FUp2MZsGreenGGGS的双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图3为重组表达载体FU(32MZsGreenGGGS转染的293FT细胞的荧光显微 图(400倍放大)；图4为融合蛋白(32M-ZsGreen的十二烷基石克酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)图5为在不同浓度的融合蛋白(32M-ZsGreen存在下检测HBVcl8-27肽与 MHC-I类分子的亲和力的流式细胞(FACS)图6为在相同浓度的融合蛋白p2M-ZsGreen存在下4企测不同抗原肽与 MHC-I类分子的亲和力的FACS图7为采用间接免疫荧光法检测不同抗原肽与MHC-I类分子的亲和力的 FACS图。6本专利技术的融合蛋白(32M-ZsGreen,其氨基酸序列包括与SEQ ID No. 1所示序 列具有至少85%相同性的第一区和与SEQ ID No.2所示序列具有至少85%相同 性的第二区；其中SEQ ID No.l所示序列是由102个氨基酸组成的p2M的氨 基酸序列，SEQIDNo.2所示序列是由242个氨基酸组成的ZsGreen的氨基酸序 列；在本领域中，至少有85%序列相同性的蛋白，通常不会改变天然蛋白的生 物学活性；因此，本专利技术的融合蛋白p2M-ZsGreen,包括由p2M或其衍生蛋白 组成的第一区和由ZsGreen或其衍生蛋白组成的第二区；这些衍生蛋白包括但 不限于(1 )有一个或几个氨基酸残基被取代、缺失或/和插入的蛋白，取代或 插入的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；(2)在一个或多个氨 基酸残基中具有取代基团的蛋白；(3)附加的氨基酸序列(如前导序列、分泌 序列、用于纯化该蛋白的序列等)融合到天然蛋白序列而形成的蛋白。在本专利技术的融合蛋白(32M-ZsGreen中，可以是第一区和第二区直接连接， 也可以是第一区和第二区通过连接肽连接。连接肽在物理上将第一区和第二区 分隔开来，有利于(32M和ZsGreen折叠成相互独立的结构域，消除二者之间可 能存在的相互干扰，使各自更好地发挥生理作用；还有利于P2M最大可能地与 抗原肽和MHC-I类分子结合，不受空间位阻的影响等。通常，连接肽不影响或 较少影响P2M的氨基酸序列和ZsGreen的氨基酸序列形成正确的折叠和空间构 象。优选的连接肽包括但不限于由SEQIDNo.3所示氨基酸序列组成的短肽。本专利技术涉及编码所述融合蛋白f32M-ZsGreen的基因，包括但不限于由SEQ IDNo.4所示核苷酸序列组成的多核苷酸。核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示的基 因由1101个核苦酸组成，编码由第一区(如SEQIDNo.l所示)的羧基端与第 二区(如SEQ ID No.2所示)的氨基端通过连接肽(如SEQ ID No.3所示)连接 且蛋白羧基端具有组氨酸标签(His6)的融合蛋白p2M-本文档来自技高网...
【技术保护点】
β２微球蛋白与绿色荧光蛋白的融合蛋白，其氨基酸序列包括与ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１所示序列具有至少８５％相同性的第一区和与ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２所示序列具有至少８５％相同性的第二区。
【技术特征摘要】
1、β2微球蛋白与绿色荧光蛋白的融合蛋白，其氨基酸序列包括与SEQ IDNo.1所示序列具有至少85％相同性的第一区和与SEQ ID No.2所示序列具有至少85％相同性的第二区。2、 根据权利要求1所述的P2微球蛋白与绿色荧光蛋白的融合蛋白，其氨 基酸序列包>^如SEQIDNo.l所示的第一区和如SEQ ID No.2所示的第二区。3、 根据权利要求2所述的P2微球蛋白与绿色荧光蛋白的融合蛋白，其特 征在于所述第一区的羧基端与第二区的氨基端连接。4、 根据权利要求3所述的P2微球蛋白与绿色荧光蛋白的融合蛋白，其特 征在于所述第一区与第二区通过連接肽连接，所述连接肽具有如SEQ ID No.3 所示的氨基酸序列。5、 编码权利要求1至4任一权利要求所迷的(32微球蛋白与绿色萸光蛋白 的融合蛋白的基因。6、 根据权利要求5所述的基因，其核苦酸序列如SEQIDNo.4所示。7、 含有权利要求5所述的基因的重组表达载体。8、 制备权利要求1至4任一权利要求所迷的p2微球蛋白与绿色荧光蛋白 的融合蛋白的方法，包括以下步骤a、 融合蛋白的表达取293FT细胞，用含有小牛血清的DMEM高糖培养液，在温度37。C、 C02 气体浓度为50mL/mS的条件下培养过夜，待细胞密度达到60 ~ 7...
【专利技术属性】
技术研发人员：万瑛，王昊亮，吴玉章，熊锐华，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。