胎儿甲种球蛋白检测微粒、其制备及应用制造技术

本发明专利技术涉及胎儿甲种球蛋白的诊断试剂，公开了一种胎儿甲种球蛋白的检测微粒，为抗－ＡＦＰ抗体包被的发光微粒。本发明专利技术还公开了上述胎儿甲种球蛋白的检测微粒的制备及应用。此外，本发明专利技术又进一步公开了一种测定样品中胎儿甲种球蛋白的体外检测试剂盒，同时公开了该试剂盒的使用方法。本发明专利技术的试剂盒可定量测定人血清样品中胎儿甲种球蛋白，可以与其它血清和临床信息联合用于癌症的辅助诊断及癌症病人治疗效果的监测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及癌症的诊断试剂，具体涉及基于光激化学发光原理的胎儿甲种球蛋白 (AFP)检测颗粒、其制备及应用。
技术介绍
免疫学检测是基于抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种手段，由于其可以利 用同位素、酶、化学发光物质等对被检测信号进行放大和显示，因此常被用于检测蛋白质， 激素等微量生物活性物质。 我国免疫学检测基本经历了放射免疫检测(兴起于20世纪70年代，现仍普遍使 用于县级以上医院)；酶联免疫检测(兴起于20世纪80年代，各临床机构普遍使用)；以化 学发光为代表的生物学标记及免疫检测技术(20世纪90年代开始推广使用，产品步入成长 期)三个阶段。这一衍变过程主要是基于对检测方法的敏感性、准确性、以及操作简捷性的 需求的不断提高而决定的。 化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay)是近十年来在世界范围内 发展非常迅速的非放射性免疫分析技术。检测原理是以发光物质作为信号放大系统并籍助 其发光强度直接测定免疫结合。由于其高灵敏度，检测范围宽等优点，已成为放射性免疫分 析与普通酶免疫分析的取代者，是免疫学检测重要的发展方向。 但目前国内自行研制的化学发光检测试剂，大多为非均相反应，采用化学底物直 接标记，通过化学反应激发。其分析过程与传统酶标检测类似，需反复清洗与分离，检测耗 时长，自动化程度不高。国外厂家检测试剂随发光基质与检测形式而各不相同。以Abbott， Bayer与Chiron等公司为代表的化学激发，即以化学发光底物直接标记抗原或抗体进行免 疫测定。最常用的为吖啶酯，在碱性环境中可被过氧化氢氧化而发光。BD则以AKP，金钢 脘为基质采用酶促化学发光。Roche为则采用电化学发光(electrochemiluminescence， ECL)，发光底物二价的三联吡啶钌及反应参与物三丙胺在电极表面失去电子而被氧化。氧 化的三丙胺失去一个H+而成为强还原剂，将氧化型的三价钌还原为激发态的二价钌，随即 释放光子而恢复为基态的发光底物。这一过程在电极表面周而复始地进行，不断地发出光 子而常保持底物浓度的恒定。因反应过程中牵涉到分离清洗，自动化设计复杂，仪器相当昂 贵。此外，发光基质的稳定性也是一大问题。 光激化学发光法通过引入激光技术与纳米微球技术，成功地解决了上述不足。因 反应在均相中进行，既加快了反应速度，又避免了反复分离与清洗步骤，能有效降低检测背 景值，减少反应时间，并可实现自动化操作。目前，PE公司推出了针对生物研究用的光激化 学发光试剂Alpha-Screen。但在临床检测领域，还没有面世的光激化学发光检测试剂，尤其 是用于肿瘤标志物与肝炎检测项目。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可用于定量检测胎儿甲种球蛋白(AFP)的检测微粒，其4制备、检测条件及应用。 本专利技术的技术原理 本专利技术的胎儿甲种球蛋白(AFP)检测试剂及试剂盒与光激化学发光检测技术相 关，光激化学发光免疫技术是一种利用化学发光物质发射的光波进行免疫测定的方法。该 技术主要整合了高分子微粒技术，有机合成，蛋白质化学与临床检测相关领域的研究。 本专利技术之所以能检测胎儿甲种球蛋白(AFP)，是由于在均相条件下，将内部带有染 料的感光微粒(纳米级)以及包被有抗-AFP抗体并且内部带有发光化合物的发光微粒(纳 米级)的混合物作为试剂和检测样品混合。此时纳米感光微粒和包被有抗-AFP抗体的纳 米发光微粒可迅速有效地捕捉AFP，在近距离内，三者形成免疫夹心复合物。激发光照射后， 纳米感光微粒中的染料被诱导激活，并释放高能态的活性氧离子(单线态氧)。该高能态的 活性氧离子被近距离的纳米发光微粒俘获，从而传递能量以激活所述发光微粒中的发光化 合物。数微秒后，发光微粒中的发光化合物将释放出高能级红光。用光子计数器测定这些 高能级光子，并通过电脑将光子数换算为目标分子浓度，光子数的多少即精确地反映了目 标分子的浓度。而当样本不含AFP时，无法在近距离形成免疫夹心复合物，活性氧离子也无 法传递至发光微粒表面。活性氧离子在液相中迅速衰减，检测时则无高能级红光产生。具 体原理参见图l及图2。 基于上述原理，本专利技术第一方面提供了一种用于检测胎儿甲种球蛋白(AFP)的检 测微粒，为抗-AFP抗体包被的发光微粒。 本专利技术第二方面提供了一种胎儿甲种球蛋白(AFP)的检测试剂盒，包括上述 抗-AFP抗体包被的发光微粒，试剂盒中还可包括生物素标记的抗-AFP抗体和/或亲和素 包被的感光微粒。 在试剂盒中，上述抗-AFP抗体包被的发光微粒、生物素标记的抗-AFP抗体和亲和 素包被的感光微粒分别以溶液的形式置于各自独立的容器中。上述含有抗-AFP抗体包被 的发光微粒、生物素标记的抗-AFP抗体或亲和素包被的感光微粒的溶液的溶剂可以是常 规的适合抗原抗体反应的溶剂体系，如HEPES缓冲体系、Tris缓冲体系。抗_AFP抗体包被 的发光微粒的溶剂优选PH8. 0的成分为HEPES、NaCl和EDTA-Na_2H20的HEPES缓冲液，生物 素标记的抗-AFP抗体的溶剂优选pH8. 0的成分为Tris、 NaCl和EDTA-Na_2H20的Tris缓 冲液，亲和素包被的感光微粒的溶剂优选HEPES、NaCl和EDTA-Na_2H20的HEPES缓冲液，上 述各种溶剂中还可添加起封闭和蛋白保护作用的物质如BSA以及防止微粒聚集的稳定试 剂如Tween20，出于对试剂防腐以及长期储存的考虑还可在溶剂中添加防腐剂，防腐剂优选 100U/ml庆大霉素和质量百分比为万分之五的Proclin 300作为防腐剂。 试剂盒中还可包括阳性对照、阴性对照以及参考样品。参考样品为含有胎儿甲种 球蛋白的溶液，其胎儿甲种球蛋白的浓度为乙型肝炎表面抗原临床cutoff点对应的浓度。 在用于定量检测胎儿甲种球蛋白(AFP)时，上述试剂盒中还可包括含有多种确定 浓度胎儿甲种球蛋白(AFP)的溶液。上述不同胎儿甲种球蛋白(AFP)浓度的溶液分别独立 包装。 上述发光微粒是指填充有发光化合物和镧系元素化合物的高分子微粒。发光化合 物可以是Dioxene(二氧杂环己烯)或thioxene ( 二甲基噻吩)的衍生物等，镧系元素化合 物可以是Eu (TTA) 3/TOPO或Eu (TTA) 3/Phen等，该微粒可由市场上购得。5 研究发现，由于最终的检测反应是均相反应，发光微粒的粒径(微粒的平均直径) 太大(> 400nm)会自然沉降，影响检测效果，微粒的粒径太小(< 50nm)，会使制备过程 中的清洗工作比较困难，对抗体连接工作不利，因此发光微粒的粒径范围应在50-400nm之 间，较好为100-300nm之间，优选250nm。 发光微粒的表面官能团可以是任何能联接蛋白质的基团，但最常用的主要有羧基 和醛基表面官能团的微粒。使用不同的微粒表面官能团，连接抗体的反应方式和条件也不 相同。 鉴于获得更好的抗-AFP抗体连接效率，试剂稳定性和连接重复性，在采用之后记 载的改进方法作为抗体的连接方法时优选羧基表面官能团的微粒。 发光微粒的发光量会直接影响最终检测的发光效果。市场提供的发光微粒发光量 一般会在50， 000-10， 000， 000光子数/本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测胎儿甲种球蛋白的检测微粒，为抗－ＡＦＰ抗体包被的发光微粒。

【技术特征摘要】
一种用于检测胎儿甲种球蛋白的检测微粒，为抗-AFP抗体包被的发光微粒。2. 如权利要求1所述用于检测胎儿甲种球蛋白的检测微粒，其特征在于，所述发光微 粒粒径为50nm到400nm。3. 如权利要求1所述用于检测胎儿甲种球蛋白的检测微粒，其特征在于，所述发光微 粒表面官能团选自羧基或醛基。4. 如权利要求1所述用于检测胎儿甲种球蛋白的检测微粒，其特征在于，所述发光微 粒的发光量为150， 000-350， 000光子数/100 y g发光微粒。5. 如权利要求1-4中任一权利要求所述用于检测胎儿甲种球蛋白的检测微粒，其特征 在于，所述检测微粒经如下工艺制得a) 混合将发光微粒与抗-AFP抗体混合于缓冲液中；b) 反应加入缓冲液配制的EDAC溶液混合并反应；c) 往步骤b获得的反应液中加入缓冲液配制的BSA溶液混匀并反应；d) 清洗产物，获得抗-AFP抗体包被的发光微粒。6. 如权利要求5所述用于检测胎儿甲种球蛋白的检测微粒，其特征在于，所述缓冲液 为MES缓冲液。7. 如权利要求5所述用于检测胎儿甲种球蛋白的检测微粒，其特征在于，所述步骤a 中，发光微粒与抗-AFP抗体的质量比例为(8-15) : 1。8. 如权利要求7所述用于检测胎儿甲种球蛋白的检测微粒，其特征在于，所述，发光微 粒与抗-AFP抗体的质量比例为12. 5 : 1。9. 如权利要求5所述用于检测胎儿甲种球蛋白的检测微粒，其特征在于，所述步骤d的 清洗的方式为离心法清洗。10. —种胎儿甲种球蛋白的检测试剂盒，包括权利要求1-9中任一权利要求所述用于 检测胎儿甲种球蛋白的检测微粒。11. 如权利要求io所述胎儿甲种球蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括生物素标记的抗-AFP抗体或亲和素包被的感光微粒中的一种或两种。12. 如权利要求11所述胎儿甲种球蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述生物素标记 的抗-AFP抗体中，生物素与抗体的分子比例为(10-20) : 1。13. 如权利要求11所述胎儿甲种球蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述亲和素包被 的感光微粒中，亲和素与感光微粒的质量比例为1 : (3-10)。14. 如权利要求11所述胎儿甲种球蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述用于检测胎 儿甲种球蛋白的检测微粒、生物素标记的抗-AFP抗体以及亲和素包被的感光微粒分别独 立包装，且均为混悬液。15. 如权利要求14所述胎儿甲种球蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述混悬液的溶 剂选自HEPES缓冲体系或Tris缓冲体系。16. 如权利要求15所述胎儿甲种球蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述用于检测胎 儿甲种球蛋白的检测微粒混悬液的溶剂为PH8. 0的成分为HEPES、NaCl和EDTA-Na_2H20的 HEPES缓冲液。17. 如权利要求15所述胎儿甲种球蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述生物素标记 的抗-AFP抗体混悬液的溶剂为pH8. 0的成分为Tris、 NaCl和EDTA-Na_2H20的Tris缓冲液。18. 如权利要求15所述胎儿甲种球蛋白的检测试剂盒，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵卫国，王海蛟，陈晨辉，
申请(专利权)人：博阳生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]