肿瘤血管靶向性肽新型肿瘤坏死因子融合蛋白制造技术

本发明专利技术属于医药生物技术领域，具体涉及基因克隆、外源基因在原核细胞中的表达、目的蛋白质的纯化、肿瘤血管靶向性肽新型肿瘤坏死因子融合蛋白，其特征在于：应用噬菌体肽库体内筛选技术，得到了能与胃癌血管特异性结合的噬菌体小肽，将其与新型人肿瘤坏死因子α（ｒｍｈＴＮＦ）融合在大肠杆菌中获得高效表达，利用硫酸铵盐析和阴阳离子交换的方法对目的蛋白进行纯化，将得到的目的蛋白进行了活性测试。其既具有新型重组人肿瘤坏死因子高效低毒的优点，又能在胃癌组织新生血管处富集，从而进一步降低新型重组人肿瘤坏死因子的临床用药量，提高量效比，降低胃癌治疗中的毒副作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医药生物
，具体涉及基因克隆、外源基因在原核细胞中的 表达、目的蛋白质的纯化、肿瘤血管靶向性肽新型肿瘤坏死因子融合蛋白。
技术介绍
肿瘤血管抑制治疗相关研究及存在的问题肿瘤血管生成是肿瘤迅速增殖的前提条件，抑制肿瘤血管生成是肿瘤治疗的一 种重要途径。目前肿瘤血管抑制治疗主要分为以下途径①阻断促进血管生成的调 节因子。血管生长刺激因子VEGF等是肿瘤细胞中最常发现的促血管生长因子，也 是血管治疗中的主要耙分子。②增强抑制血管生长的调节因子。如增强抑制性细胞 因子、生长因子拮抗剂等是肿瘤血管治疗中最直接的手段，目前已有多种抑制调节 因子进入临床前期试验阶段。③已形成血管的阻断疗法。诱导肿瘤组织中已存在的 血管急性损伤能够有效抑制肿瘤的增殖。④肿瘤血管抑制基因治疗。由于基因治疗 的目标是核酸，具有设计简单、特异性强和毒性小等优点，目前已广泛用于实验研 究中。尽管目前在肿瘤血管生成方面的研究取得了很大的突破，但仍存在不足之处。首 先，肿瘤血管针对性治疗不强。由于检测肿瘤血管特异性的分子标志物存在着很多 困难这些分子只存在于肿瘤血管，正常血管中并不存在；表达的量较小，难以检 测，更无法纯化。找出肿瘤血管特异性标志物是对肿瘤血管进行靶向治疗的关键。 其次，目前进入临床实验多数血管生成抑制分子进入体内表达效率低，不能在肿瘤 血管局部维持治疗浓度。只有当这些抑制血管或者肿瘤生成的药物具有耙向性的时 候，才能使药物在体内表达效率增高，治疗浓度增大，达到有效治疗。 特异性结合多肽的研究现状针对以上的不足，噬菌体随机肽库的应用成功的解决了这一难题并为人们大规 模发展和筛选新型抗肿瘤药物提供了强有力的手段。随着噬菌体展示多肽库技术的 发展，应用小肽模拟抗原抗体反应已成为发展的趋势。这是因为(l)含有关键残基 的短肽能够模拟蛋白质上的抗原决定簇；(2)多数情况下，几个关键残基与它的结合 分子所形成的非共价键构成了全部结合的主要部分，即蛋白质之间的相互作用是通 过局部肽段间的相互作用实现的。这类导向性药物，不仅具有结合特异性和高效性， 还克服了单抗效应剂分子量较大，穿透能力弱的缺点。目前，基于导向药物中导向 分子小型化的发展趋势，利用噬菌体展示多肽库技术筛选出能够与目的分子结合的 短肽，在体外合成编码这一短肽的核苷酸序列，与弹头分子基因融合，表达出具有 导向作用的多肽一弹头分子，由短肽发挥导向作用，弹头分子可以是细菌毒素、细 胞因子、化疗药物等，这一药物设计策略已显示出良好的应用前景。已有研究显示各种组织器官都存在着组织器官特异性亲和蛋白，因此不同种类 的肿瘤血管也会有不同的特异性亲和蛋白，即异质性(Molecular heterogeneity)。 Pasqualini等人也通过噬菌体随机肽库体内淘洗法并获得了包括脑、肾、肺、胰、皮 肤等多种正常组织器官血管内皮结合的不同的噬菌体短肽。Wadih Arap等采用噬菌 体随机肽库技术发现能够与前列腺肿瘤血管特异性结合的小肽SMSIARL。Angelo Coni等利用基因工程手段，将从噬菌体展示肽库中筛选出的能特异性与 氨肽酶(CD13)结合的五肽CNGRC通过一个甘氨酸连到天然人肿瘤坏死因子的氨基4端，实验证明，改建后的融合蛋白在体外肿瘤细胞杀伤实验中具有与天然肿瘤坏死,因子相近的活性，在体内实验中，与天然肿瘤坏死因子相比，改建后的融合蛋白具有更高的量效比，更低的毒副反应。在移植肿瘤生长12天以后，CNGRC-TNF和TNF 二者的杀伤活性出现明显差别，说明CNGRC-TNF可能通过作用于肿瘤的新生血管而具有较高的量效比。证实了特异性结合多肽作为导向分子的合理性和可行性。目前筛选多肽的方法有体内筛选和体外筛选两种，体外筛选主要针对目的肿瘤或组织的细胞系进行筛选，方法比较简单，但是无法准确模拟体内环境，筛选出的多肽在应用到体内时靶向效果不好。体内筛选就弥补了这个不足，体内筛选要建出合适的动物模型，方法上比较复杂，但是其来源于体内环境，应用于体内时效果较好。肿瘤坏死因子是一种多功能的细胞因子，参与机体的免疫代谢调节，对某些癌细胞具有增殖抑制和细胞毒作用。肿瘤坏死因子还是一种感染性介导因子，在机体的炎症中起重要作用。肿瘤坏死因子的生物效应抗肿瘤及抑瘤作用肿瘤坏死因子对多种肿瘤均有杀伤或抑制作用，敏感性因肿瘤细胞类型而异。肿瘤坏死因子的抑瘤机制尚不完全清楚，可能包括①、肿瘤坏死因子为激发性细胞因子，可启动广泛的免疫炎性反应，介导自然杀伤细胞、单核细胞和巨噬细胞对癌细胞的杀伤作用；②、肿瘤坏死因子可作用于血管内皮细胞，使肿瘤的血管变形受损或形成血栓，导致肿瘤发生出血性坏死或营养缺乏而消退；③、肿瘤坏死因子可通过诱导某些肿瘤细胞凋亡来抑制肿瘤细胞增生。抗病毒作用肿瘤坏死因子呈剂量依赖性地抑制病毒介导的细胞病变的发展，对DNA病毒和RNA病毒均有抑制作用。肿瘤坏死因子可以诱导未感染细胞产生抗病毒能力，还可选择性的杀伤病毒感染的细胞。现已证实，多种病毒等也可刺激肿瘤坏死因子的产生。免疫调节作用肿瘤坏死因子能够增强T细胞产生以IL-2为主的淋巴因子，提高IL-2的表达水平，从而促进T细胞的增殖；还能促进B细胞的增殖、分化和产生抗体。此外，肿瘤坏死因子还能诱导单核-巨噬细胞系统的前体细胞分化，增强其吞噬能力和氧化代谢水平，提高巨噬细胞抗原提呈能力。并可促进骨髓基质细胞和巨噬细胞产生CSF，特别是GM-CSF，可促使骨髓释放中性粒细胞和巨噬细胞。肿瘤坏死因子还可以诱发炎症反应，是一种急性期反应的强力诱导剂。对结缔组织的作用可诱导破骨细胞吸收骨质、促进软骨细胞进行软骨更新，抑制新骨形成。肿瘤坏死因子还可以刺激成纤维细胞和滑膜细胞的增生，引起关节组织的纤维化和增生。肿瘤坏死因子的应用现状由于肿瘤坏死因子的抗肿瘤作用和多种免疫调节作用，肿瘤坏死因子疗法的临床研究已在许多国家开展。动物实验和临床研究均表明肿瘤坏死因子对某些肿瘤具有明显的抑制作用，但是由于副作用较大，限制了它的临床应用。肿瘤坏死因子的副作用包括发热、头痛、恶心、呕吐、全身倦怠、肌肉酸痛等；高剂量时可导致休克、肾功能不全和DIC形成等。建立合理的用药方案及治疗措施，可望降低用量，减轻副作用，达到最佳治疗效果。静脉注射rhTNF可使部分肿瘤缩小，但是副作用大，人体很难耐受。瘤内注射可在局部出现坏死，且副作用较轻，对某些肿瘤的治疗效果优于静脉注射。已报告的有效病例包括肾癌、胃癌、肝癌等，并使转移性大肠癌腹水减少。肿瘤坏死因子与其他药物的联合应用单独使用TNF用量大，不容易获得好的效果，患者常因不能耐受其副作用而中止用药。将其它具有肿瘤抑制作用的细胞因子(如IL-2、 IFN等)或某些抗肿瘤药物(如ADM、 MMC、 DDP)与TNF联合应用，既可减少各种药物的用量、降低毒副作用，又可提高疗效，不失为肿瘤治疗的一种可行方法。肿瘤坏死因子的定位基因突变:根据对TNF结构与功能关系的研究结果，对TNF的核苷酸的置换、插入或删除来定向改变基因的序列，从而达到使TNF增效减毒的目的。用该法已获得了大量的TNF衍生物。尽管对肿瘤坏死因子的改构或者与其他药物联用可在一定程度上降低其全身毒副作用，但其仍然是作用于全身各个脏器，对本文档来自技高网...

【技术保护点】
肿瘤血管靶向性肽新型肿瘤坏死因子融合蛋白，其特征在于：将合成的胃癌血管特异性结合的小肽ＧＸ１与新型人肿瘤坏死因子α融合在大肠杆菌中获得高效表达，其基因的序列如下：　ＧＡＡ　ＴＴＣ　ＡＴＧ　ＴＧＴ　ＧＧＴ　ＡＡＴ　ＴＣＴ　 ＡＡＴ　ＣＣＴ　ＡＡＧ　ＴＣＧ　ＴＧＣ　ＧＧＡ　ＴＣＣ　ＣＧＣ　ＡＡＡ　ＣＧＴ　ＡＡＧ　ＣＣＴ　ＧＴＡ　ＧＣＣ　ＣＡＴ　ＧＴＴ　ＧＴＡ　ＧＣＡ　ＡＡＣ　ＣＣＴ　ＣＡＡ　ＧＣＴ　ＧＡＧ　ＧＧＧ 　ＣＡＧ　ＣＴＣ　ＣＡＧ　ＴＧＧ　ＣＴＧ　ＡＡＣ　ＣＧＣ　ＣＧＧ　ＧＣＣ　ＡＡＴ　ＧＣＣ　ＣＴＣ　ＣＴＧ　ＧＣＣ　ＡＡＴ　ＧＧＣ　ＧＴＧ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＡＧＡ　ＧＡＴ　ＡＡＣ　ＣＡＧ　 　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＧＴＧ　ＣＣＡ　ＴＣＡ　ＧＡＧ　ＧＧＣ　ＣＴＧ　ＴＡＣ　ＣＴＣ　ＡＴＣ　ＴＡＣ　ＴＣＣ　ＣＡＧ　ＧＴＣ　ＣＴＣ　ＴＴＣ　ＡＡＧ　ＧＧＣ　ＣＡＡ　ＧＧＣ　ＴＧＣ　ＣＣＣ　 ＴＣＣ　ＡＣＣ　ＣＡＴ　ＧＴＧ　ＣＴＣ　ＣＴＣ　ＡＣＣ　ＣＡＣ　ＡＣＣ　ＡＴＣ　ＡＧＣ　ＣＧＣ　ＡＴＣ　ＧＣＣ　ＧＴＣ　ＴＣＣ　ＴＡＣ　ＣＡＧ　ＡＣＣ　ＡＡＧ　ＧＴＣ　ＡＡＣ　ＣＴＣ　ＣＴＣ 　ＴＣＴ　ＧＣＣ　ＡＴＣ　ＡＡＧ　ＡＧＣ　ＣＣＣ　ＴＧＣ　ＣＡＧ　ＡＧＧ　ＧＡＧ　ＡＣＣ　ＣＣＡ　ＧＡＧ　ＧＧＧ　ＧＣＴ　ＧＡＧ　ＧＣＣ　ＡＡＧ　ＣＣＣ　ＴＧＧ　ＴＡＴ　ＧＡＧ　ＣＣＣ　 　ＡＴＣ　ＴＡＴ　ＣＴＧ　ＧＧＡ　ＧＧＧ　ＧＴＣ　ＴＴＣ　ＣＡＧ　ＣＴＧ　ＧＡＧ　ＡＡＧ　ＧＧＴ　ＧＡＣ　ＣＧＡ　ＣＴＣ　ＡＧＣ　ＧＣＴ　ＧＡＧ　ＡＴＣ　ＡＡＴ　ＣＧＧ　ＣＣＣ　ＧＡＣ　ＴＡ Ｔ　ＣＴＣ　ＧＡＣ　ＴＴＴ　ＧＣＣ　ＧＡＧ　ＴＣＴ　ＧＧＧ　ＣＡＧ　ＧＴＣ　ＴＡＣ　ＴＴＴ　ＧＧＧ　ＡＴＣ　ＡＴＴ　ＧＣＣ　ＴＴＣ　ＴＧＡ　ＣＴＧ　ＣＡＧ。...

【技术特征摘要】
1、肿瘤血管靶向性肽新型肿瘤坏死因子融合蛋白，其特征在于将合成的胃癌血管特异性结合的小肽GX1与新型人肿瘤坏死因子α融合在大肠杆菌中获得高效表达，其基因的序列如下GAA TTC ATG TGT GGT AAT TCT AAT CCT AAG TCG TGC GGA TCC CGCAAA CGT AAG CCT GTA GCC CAT GTT GTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGGCAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AATGGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGCCTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCCTCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCCTAC CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAGAGG GAG ACC CCA GAG GGG GCT GAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCCATC TAT CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTG GAG AAG GGT GAC CGA CTC AGCGCT GAG ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GAC TTT GCC GAG TCT GGG CAGGTC TAC TTT GGGATC ATT GCC TTC TGA CTG CAG2、 根据权利要求1所述的肿瘤血管靶向性肽新型肿瘤坏死因子融合蛋白，其制备方法是1) 合成含有酶切位点的小肽CGNSNPKSC (GXl);2) GXl-rmhTNF融合蛋白基因的克隆及构建；3) 重组蛋白的诱导表达；4) 重组蛋白的纯化；5) 重组蛋白的体外生物学活性检测；6) 重组蛋白的体内生物学活性检测。3、 根据权利要求3所述的肿瘤血管靶向性肽新型肿瘤坏死因子融合蛋白的制备 方法，其特征在于所述的GXl-rmhTNF融合蛋白基因的克隆及构建中 pBV220-rmhTNF质粒，它的克隆位点是EcoRl,BamHl和Pstl;按照大肠杆菌惯用 密码子设计并合成了编码GXl导向肽的含有酶切位点的核酸片断5'AATTC ATG TGT GGT AAT TCT AAT CCT AAG TCG TGC G3'将合成的片断于93'...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹珊珊，吴开春，张英起，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：87[中国|西安]