一种锌指蛋白基因的新用途制造技术

本发明专利技术公开了一种锌指蛋白基因的新用途。锌指蛋白基因即编码序列表中序列１所示蛋白的基因的新用途是在培育抗双生病毒植物中的应用。培育抗双生病毒的植物的方法，是将植物中编码序列表中序列１所示蛋白的基因灭活，获得抗双生病毒的植物。灭活该基因的突变体对病毒侵染的敏感性降低，对农业生产具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种锌指蛋白基因的新用途。
技术介绍
双生病毒(Geminivirus)是一类具有双生颗粒形态的植物单链环状DNA病毒。它在自然界中的宿主很广，包括许多重要的经济作物。双生病毒病对农业生产造成巨大损失。甜菜曲顶病毒(BSCTV， beet severe curly top virus)是双生病毒的一个种，也是少数能感染模式植物拟南芥的双生病毒之一。 双生病毒的扩增是通过滚环复制的方式在宿主植物的细胞核中进行的。由于双生病毒的基因组编码的蛋白种类很少，所以双生病毒的复制主要依赖宿主的因子。双生病毒侵染的细胞大多数都是分化的细胞，双生病毒的DNA在分化的细胞中很难复制，所以双生病毒必须诱导宿主细胞重新进入细胞周期，从而为病毒的复制创造良好的环境。 近期国际上的一些报道为研究双生病毒与宿主细胞周期的关系提供了一些线索双链DNA形式的病毒在植物细胞S期的细胞核里大量积累；植物中的DNA复制相关蛋白PCNA的表达量受到双生病毒TGMV的诱导非常明显；某些双生病毒的R印或R印A蛋白能够与植物细胞的G/S期转换激活子RBR相互作用，从而调控植物的细胞周期。 很多双生病毒的侵染都能诱导植物细胞分裂，从而使植物产生叶脉弯曲等症状。其中，一种双生病毒甜菜曲顶病毒编码的C4蛋白被认为是一个主要的病症决定因子。在烟草中表达甜菜曲顶病毒的C4导致烟草不正常的细胞分裂。另外， 一些病毒种的C4蛋白可能参与病毒的移动和基因沉默抑制等过程。 在真核细胞中，细胞周期调控的机制是比较保守的。植物细胞周期主要由CDK/cyclin复合物调控。CDK/cyclin复合物的活性会被CDK的抑制子(CKI)所抑制。在拟南芥中有七个与哺乳动物CKIp27同源的蛋白，被称为KRP或者ICK蛋白。在植物中过表达KRP/ICK蛋白会使植物的细胞减少从而阻碍植物的生长。在哺乳动物中，CKIp27通过两条途径进行降解，一条是通过细胞核内的SCFskp2，另一条通过细胞质中的KPC途径，该途径包括两个蛋白KPC1和KPC2。最近，在植物中发现了一个相似的KRP/ICK蛋白降解的冗余调控机制。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种锌指蛋白基因的新用途。 该新用途是编码锌指蛋白(序列表中序列1所示蛋白)基因(At2g22010)在培育抗双生病毒植物中的应用。 上述锌指蛋白来源于拟南芥。本专利技术的专利技术人发现其表达受甜菜曲顶病毒(BSCTV)的C4蛋白诱导，该基因与人类的KPC1同源，被命名为RKP(Related to KPC1)基因。其中，所述RKP基因的编码序列具体可是序列表中的序列2。所述RKP基因可用来培育抗双生病毒的转基因单子叶植物和双子叶植物。 所述双生病毒具体可为甜菜曲顶病毒。 本专利技术的另一个目的是提供一种培育抗双生病毒植物的方法。 本专利技术所提供的培育抗双生病毒植物的方法，是将植物中编码序列表中序列1所示蛋白的基因灭活，获得抗双生病毒植物。 其中，将植物中编码序列表中序列1所示蛋白的基因灭活可用本领域已知的各种方法，如用T-DNA插入灭活方法，定点突变、定点置换，同源重组等。所述基因的编码序列具体可是序列表中的序列2。所述双生病毒具体可为甜菜曲顶病毒。 实验证明，RKP (Related to KPC1)基因被灭活的拟南芥突变体，与野生型拟南芥相比，提高了对甜菜曲顶病毒的抗性。利用本专利技术的RKP基因培育抗双生病毒植物对农业生产具有重要的意义。附图说明 图1为BSCTV的C4蛋白诱导拟南芥的不正常的细胞分裂 a为长时间的雌激素诱导条件下，诱导表达C4基因的拟南芥产生的愈伤组织； b为组成型表达BSCTV的C4蛋白的拟南芥形成愈伤组织。 图2为C4蛋白和BSCTV的侵染诱导RKP基因的表达 a为RT-PCR分析RKP基因的表达；b为GUS活性的检测结果；c为BSCTV侵染后，拟南芥中RKP基因的表达。 图3为RKP基因缺失突变体的验证 a为PCR验证结果； 图中，P3+P4表示引物P3和P4的扩增结果，LB1+P4表示引物LB1和P4的扩增结果，p745+P3表示引物p745和P3的扩增结果，LBbl+P3表示引物LBbl和P3的扩增结果 b为RT-PCR验证结果。 P1+P1表示引物Pl和P2的扩增结果 P3+P4表示引物P3和P4的扩增结果 图4为RKP基因突变体对BSCTV的敏感性 a为侵染后不同时间点出现病症植物的百分比；b为拟南芥(整体植物)中BSCTV核酸积累的相对水平；c为病症拟南芥莲座叶BSCTV核酸积累的相对水平；d为拟南芥原生质体中BSCTV核酸积累的相对水平。具体实施例方式下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。 实施例1、 RKP基因(At2g22010)在抗病毒侵染中的应用 —、 RKP基因(At2g22010)突变体抗甜菜曲顶病毒的侵染 1)拟南芥中表达甜菜曲顶病毒(BSCTV)的C4蛋白影响植物的细胞分裂 通过PCR方法扩增全长264个碱基的C4基因(GeneID : 1489875)，然后C4基因克隆到pCAMBIA1300-221 (CAMBIA， Canberra, Australia)上，构建重组表达载体pCAMBIA1300-221-C4。 pCAMBIA1221-C4转化农杆菌EHA105，获得重组菌EHA105-C4，EHA105-C4转化拟南芥哥伦比亚生态型，获得组成型过表达C4基因的拟南芥。组成型过表达C4基因的拟南芥不能形成正常的植株，而是形成愈伤组织(图lb)。 通过PCR方法扩增全长264个碱基的C4基因(GeneID : 1489875)，然后C4基因克隆到C表达载体pER8中，构建重组表达载体pER8-C4。 pER8-C4转化农杆菌EHA105，获得重组菌，然后用上述的方法转化哥伦比亚生态型拟南芥，获得诱导表达C4基因的拟南芥，诱导表达C4基因的拟南芥的种子在不受雌激素诱导时可以形成正常的植株；将萌发后的正常的植株转入含有2 y M雌激素的培养基中，植株的生长将会受到抑制，叶子会发生巻曲，根的生长停止；转入含有2 ii M雌激素的培养基中40天之后，植株将会产生类似于组成型过表达C4基因的拟南芥形成的愈伤组织(图la)。 2)RKP基因的表达可受BSCTV的C4蛋白和BSCTV侵染的诱导 提取用2yM雌激素处理了 16小时的诱导表达C4基因的拟南芥和哥伦比亚生态型拟南芥的RNA，分别用ATH拟南芥全基因组芯片(Affymetrix公司)进行微阵列分析。 微阵列分析表明，与对照植物相比，很多基因的表达受到上调或者下调。其中，有一个基因的表达受到C4蛋白的明显诱导。该基因的基因号是At2g22010，与人类的一个细胞周期调控蛋白KPC1同源，命名为RKP基因。RT-PCR进一步检测At2g22010的表达水平，所用引物RT Fw和RT Rev的核苷酸序列如下5' -TTCGTAGTTACACACTTCAAC-3':5' -TCATGTGCTTCTTTTGTGACC-3'。以ACTIN1作为内参，检测结果如图2a所示，表明RKP基因的表达受到C4蛋白的明显诱导，图2中+ 代表2iiM雌激素处理了 16小时的诱导表达C4基因的拟南芥，_代表哥伦比亚生态型拟南芥。为了进一本文档来自技高网...

【技术保护点】
编码序列表中序列１所示蛋白的基因在培育抗双生病毒植物中的应用。

【技术特征摘要】
编码序列表中序列1所示蛋白的基因在培育抗双生病毒植物中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述基因的编码序列是序列表中的序列2。3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述双生病毒为甜菜曲顶病毒。4. 一种培育抗双生病...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢旗，赖建彬，夏然，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]