一种筛选锌指蛋白的筛选系统技术方案

本发明专利技术公开了一种筛选锌指蛋白的筛选系统，包括两个报告载体pReport-N1-LacZ、pReport-N2-EGFP和一个激活载体pAD-RNAP-alpha-GAL4。通过构建三种元件的配合，构建两套筛选系统，利用三种元件的配合，从而实现锌指蛋白与锌指核酸酶识别序列特异性识别与报告基因表达指示的相关，再通过这两套系统的交互筛选提高锌指蛋白筛选的活性。两套系统交互验证，提高了筛选锌指蛋白的特异性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于锌指蛋白的筛选
，涉及一种筛选锌指蛋白的筛选系统。
技术介绍
转基因动物有着广泛的应用前景，通过基因打靶技术可以实现外源基因的定点整合，其表达可以实现精确调控并不影响宿主细菌自身基因表达调控。基因打靶主要依赖于同源重组，自然条件下同源重组发生的几率很低，约为百万之一，这就大大的限制了这一技术的广泛应用。如何提高基因打靶效率已经成为目前研究的重点和热点。锌指蛋白是一类具有手指状结构域的转录因子，在基因表达调控、细胞分化、胚胎发育、增强植物抗逆性等方面具有重要的作用。1996年Kim等发现，将已知的识别特异DNA序列的锌指结构与限制性内切酶FokI中无特异性识别作用的切割结构域通过一个“linker”融合表达,可以组合成一个新的限制性内切酶-锌指核酸酶(zinc fingernuclease, ZFN)，识别和切割位点由其中的锌指结构决定。ZFN是由两部分组成，包括一个DNA结合域和一个非特异性核酸内切酶。其工作原理是DNA结合域与特定DNA结构结合，与之相连的非特异性核酸内切酶随之发挥剪切作用，在结合位点产生断裂，促进同源重组，提高定点突变和置换频率。研究表明，通过特异性锌指核酸酶可以提闻基因打祀效率。锋指核酸酶的关键在于筛选闻特异性、闻未和力的锋指蛋白。锌指蛋白的获取方法主要有筛选法和模块组装法。模块组装法的优点在于简易快速简单将各锌指模块连接用于识别目标序列。缺点在于设计出的联体锌指亲和力较低或者没有亲和力。随着锌指结合DNA机制深入研究，该方法将会成为一种高效的方法；筛选法可信度较高，但比模块组装法耗时。
技术实现思路
本专利技术解决的问题在于提供一种筛选锌指蛋白的筛选系统，利用报告载体替代现有的细菌筛选系统必须将序列整合进细菌基因组里进行筛选的方法，筛选过程高效简洁。本专利技术是通过以下技术方案来实现—种筛选锌指蛋白的筛选系统，包括两个报告载体pReport_Nl-LacZ、pReport-N2-EGFP 和一个激活载体 pAD-RNAP_alpha_GAL4 ；所述的报告载体pReport-Nl-LacZ包括锌指核酸酶识别序列插入位点、核糖体结合位点和启动子，在启动子的下游设有报告基因LacZ和抗生素筛选基因；所述的报告载体pReport-N2-EGFP包括锌指核酸酶识别序列插入位点、核糖体结合位点和启动子，在启动子的下游设有报告基因EGFP和抗生素筛选基因； 所述的激活载体pAD-RNAP-alpha-GAL4包括RNA聚合酶α和激活元件GAL4。所述的报告载体pReport-Nl-LacZ的锌指核酸酶识别序列插入位点、核糖体结合位点和启动子的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示；所述的报告载体pReport-N2_EGFP的锌指核酸酶识别序列插入位点、核糖体结合位点和启动子的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。所述的报告载体pReport-Nl-LacZ和pReport-N2_EGFP上均设有单拷贝控制元件。所述的报告载体pR印ort-Nl-LacZ中的抗生素筛选基因为aada基因，报告基因LacZ和aada基因通过串联表达序列相连接；所述的报告载体pReport-N2_EGFP中的抗生素筛选基因为aada基因，报告基因EGFP和aada基因通过串联表达序列相连接；串联表达序列的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示。所述的激活载体pAD-RNAP-alpha_GAL4中的RNA聚合酶a和激活元件GAL4通过 表达五个氨基酸残基的linker序列连接。所述的五个氨基酸残基为Gly-Ser-Ala-Ala-Ala。所述的报告载体pReport-Nl-LacZ、报告载体pReport-N2_EGFP中还通过锌指核酸酶识别序列插入位点插入锌指核酸酶识别序列。所述的锌指蛋白识别序列为SEQ. ID. NO. 4 SEQ. ID. NO. 9所示的一种。所述的报告载体pR印ort-Nl-LacZ和激活载体pAD-RNAP-alpha_GAL4共转染于宿主细菌，构成LacZ报告系统；所述的报告载体pR印ort-N2_EGFP和激活载体pAD-RNAP-alpha_GAL4共转染于宿主细菌，构成EGFP报告系统。分别在LacZ报告系统和EGFP报告系统中转染待筛选的设有随机锌指蛋白和GALllP元件的随机锌指库质粒；然后添加抗生素进行筛选阳性克隆，并根据报告基因的表达筛选出锌指蛋白质粒；再将LacZ报告系统筛选到的锌指蛋白质粒通过EGFP报告系统筛选，将EGFP报告系统筛选到的锌指蛋白质粒通过LacZ报告系统筛选。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果本专利技术提供的筛选锌指蛋白的筛选系统，是一种适用于从随机锌指质粒库中与锌指核酸酶识别序列相配合、识别的锌指蛋白，通过构建三种元件的配合，构建两套筛选系统，再通过这两套系统的交互筛选提高锌指蛋白筛选的活性。巧妙利用三种元件的配合，从而实现锌指蛋白与锌指核酸酶识别序列特异性识别与报告基因表达指不的相关报告系统中的启动子包括插入位点和启动后续报告基因的启动子，在被激活的情况下启动后续的Laz报告基因和EGFP报告基因，实现不同的报告；激活系统中的RNAP-alpha GAL4，其中GAL4为激活元件，RNAP为启动报告系统中的启动子；而待筛选的随机锌指库质粒中，锌指蛋白主要是与锌指核酸酶识别序列的结合，Galllp也是激活元件；当将设有的随机锌指库质粒转染到含有报告载体与激活载体都转染到宿主细菌中，如果位于报告载体的待筛选锌指蛋白结合位点能与随机锌指质粒中的某个锌指蛋白相互作用，则激活载体上GAL4与随机锌指库质粒上的与该锌指蛋白序列结合的GALllP元件靠近并结合，GAL4与GALllP结合后促使RNA聚合酶a结合在报告载体的启动子区从而激活报告基因LacZ或EGFP的表达；如果待筛选的识别位点与锌指蛋白无相互作用则不能激活报告基因表达。而两套系统的相互验证是通过LacZ报告系统筛选得到的单克隆，提取质粒转入EGFP系统中鉴定EGFP活性；指通过EGFP报告系统筛选得到的单克隆，提取质粒转入LacZ系统中鉴定LacZ活性；通过两种系统的报告提高了筛选锌指蛋白的特异性。本专利技术提供的筛选锌指蛋白的筛选系统，筛选容量大，效率高，毒性小的特点首先筛选系统利用报告载体的单拷贝性，替代过去细菌筛选系统必须将序列整合进细菌基因组里进行筛选的方法，筛选过程高效简洁，细菌生长快，转化效率高所以可以简单且快速的检测大量的相互作用；其次，应用细菌作为宿主避免了酵母等作为宿主，其宿主蛋白影响目的蛋白之间的相互作用；同时真核蛋白转入酵母会对宿主产生毒性，转入细菌就减少了细胞毒性的产生。本专利技术提供的筛选锌指蛋白的筛选系统，以牛P酪蛋白基因上的锌指核酸酶识别位点为靶标，设计酪蛋白基因上的锌指核酸酶识别半位点，从随机锌指质粒库中筛选锌指蛋白，同时通过链霉素筛选与LacZ和链霉素与EGFP两个报告系统得到高特异性的锌指蛋白，并且筛选得到的锌指蛋白已经在牛成纤维细胞上进行了验证，其效果良好。附图说明图I 为 pRport-LacZ 质粒图谱；图2 为 HindIII 与 AvrII 双酶切 pMD19T_T_A 与 pRport-Nl 电泳图谱；图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.ー种筛选锌指蛋白的筛选系统,其特征在于，包括两个报告载体pReport-Nl-LacZ、pReport-N2-EGFP 和一个激活载体 pAD-RNAP_alpha_GAL4 ； 所述的报告载体pReport-Nl-LacZ包括锌指核酸酶识别序列插入位点、核糖体结合位点和启动子，在启动子的下游设有报告基因LacZ和抗生素筛选基因； 所述的报告载体pReport-N2-EGFP包括锌指核酸酶识别序列插入位点、核糖体结合位点和启动子，在启动子的下游设有报告基因EGFP和抗生素筛选基因； 所述的激活载体pAD-RNAP-alpha-GAL4包括RNA聚合酶α和激活元件GAL4。2.如权利要求I所述的筛选锌指蛋白的筛选系统，其特征在于，所述的报告载体pReport-Nl-LacZ的锌指核酸酶识别序列插入位点、核糖体结合位点和启动子的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示； 所述的报告载体pR印ort-N2-EGFP的锌指核酸酶识别序列插入位点、核糖体结合位点和启动子的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。3.如权利要求I所述的筛选锌指蛋白的筛选系统，其特征在于，所述的报告载体pReport-Nl-LacZ和pReport-N2_EGFP上均设有单拷贝控制元件。4.如权利要求I所述的筛选锌指蛋白的筛选系统，其特征在干，所述的报告载体pReport-Nl-LacZ中的抗生素筛选基因为aada基因，报告基因LacZ和aada基因通过串联表达序列相连接； 所述的报告载体PR印ort-N2-EGFP中的抗生素筛选基因为aada基因，报告基因EGFP和aada基因通过串联表达序列相连接； ...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨力侠，王小海，郭泽坤，张涌，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，杨凌科元克隆股份有限公司，
类型：发明
国别省市：