本发明专利技术提供了一种用于亚欧型口蹄疫病毒检测的实时荧光ＰＣＲ引物和探针，所述的引物对能特异性扩增口蹄疫病毒基因组５′－ＵＴＲ序列的保守区域，所述探针特异性针对于该引物对扩增区域中的ＧＣ高含量区，其５′端具有报告荧光染料标记，３′端具有淬灭荧光染料标记。本发明专利技术充分利用了荧光ＰＣＲ技术的高效扩增性、核酸杂交的良好特异性和荧光检测技术的快速敏感性，反应结束即时便可根据扩增曲线判定待检组织病料中是否含有亚欧型口蹄疫病毒，本发明专利技术中ＰＣＲ扩增所针对的基因组区域，为亚欧型口蹄疫病毒特异性的序列，与南非型口蹄疫病毒无交叉反应，在获得良好的特异性同时，通用性更强。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于流行病学和食品卫生检测领域，具体而言，本专利技术涉及用于亚欧型口 蹄疫病毒检测的实时荧光PCR引物和探针，以及使用其进行检测的方法，更具体地说，是对 猪、牛、羊等偶蹄类动物及相关动物产品中是否携带A、0、C以及Asia 1型口蹄疫病毒进行 检测的通用实时荧光PCR引物和探针，以及使用其进行检测的方法。
技术介绍
口 g帝疫(Foot—and—mouth di sease， FMD)是由口蹄疫病毒(Foot_and_mouth disease virus, FMDV)感染引起的偶蹄动物共患的急性、热性、高接触性传染病(江鹏斐 等，1999)，同时也是一种严重的政治经济病，列为0IE规定的A类传染病之首，同时也是 动物及动物产品国际贸易中重要的检疫对象(董志强等，2007)。目前，ELISA及病毒分离 是OIE推荐的检测方法，存在操作时间长(病毒培养需要4d时间)、敏感性低(ELISA敏感 性只有70% -80% )等缺点(花群义等，2005)。 荧光PCR(FQ-PCR)技术是美国PE (Perkin Elmer)公司1995年研制出来的一种新 的核酸定量技术，该方法自产生以来，不断发展完善，特别是随着TaqMan探针的广泛使用， 到目前为止该技术已经非常成熟，具有灵敏度高(比普通PCR高100倍以上)、特异性强(在 普通PCR —对引物的基础上，中间还设计有探针，只有引物和探针均完全配对，才可能得到 扩增，可对少至2个核苷酸的序列差异进行鉴定，从而保证了反应的特异性)、操作安全方 便(无须凝胶电泳，避免了EB染色对人体的危害)等优点，目前已被广泛应用于细菌、病毒 等病原体检测、肿瘤基因检测、免疫分析、基因表达、突变及其多态性的研究等多个领域。 目前，国内外建立了很多FMDV通用型荧光RT-PCR检测方法。但现有资料表明作 为RNA病毒，FMDV在复制过程中由于缺乏校对机制，基因组每复制一次，就有O. 1_10个核 苷酸发生变异(Gu等，2007)。在不同的生存环境、免疫压力等条件的诱导下，基因组特别是 结构蛋白编码区核苷酸变异的几率更高，很难选择在蛋白编码区设计引物/探针，建立通 用型荧光RT-PCR检测方法。同时研究表明，FMDV的七个血清型即0、 A、 C、亚洲1 (Asial) 型、南非1、2、3型(SAT1、 SAT2、 SAT3)可用核酸杂交分成两群，0、 A、 C和亚洲1型为亚欧 型FMDV，南非1、2、3型为南非型FMDV，群内各型核酸同源性达60X-70X，但两群之间仅为 25% -40% (卢曾军，2003)，因此目前还很难设计出特异性较高的亚欧型及南非型均通用 的荧光RT-PCR引物与探针。 针对目前我国尚无南非型口蹄疫疫情的现状，本专利技术在对FMDV大量基因信息进 行分析比较的基础上，选择亚欧型口蹄疫病毒高度保守的5' -UTR(非翻译区)设计引物和 探针，建立了亚欧型FMDV特异的荧光RT-PCR检测方法，从而可大大提高口蹄疫病毒PCR检 测方法的通用性，满足我国相关动物及动物产品的口蹄疫检测及监测需求。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供用于亚欧型口蹄疫病毒检测的荧光PCR引物和探针序列。 本专利技术的目的通过下述技术方案实现从GenBank中获得口蹄疫病毒(FMDV) 基因组序列，应用MegAlign软件对上述序列进行比较和一致性分析，选择较为保守的 5' -UTR(非翻译区)序列，根据引物和探针的设计原则，用软件Beacon Designer 7. 0在 这些序列的保守区域筛选到一对具有通用碱基序列的通用引物，引物对经在线序列BLAST 分析，确定为亚欧型FMDV (包括A、 0、 C以及Asia l型)区别于南非型FMDV(包括SAT-l、 SAT-2、SAT-3型)的特异性引物对。在该引物对的扩增区域内设定一条通用的荧光TaqMan 探针，报告荧光染料标记在探针的5'端，淬灭荧光染料标记在探针的3'端，两者构成能量 转移结构，即报告荧光染料所发射的荧光可被淬灭荧光染料吸收，当二者距离变远时，抑制 作用减弱，报告荧光染料信号增强。在扩增反应过程中，探针同DNA模板上的目的扩增片段 杂交，由于Taq酶具有5'端到3'端的外切酶活性，在扩增延伸阶段将探针切断，探针被水 解，从而导致报告荧光基团和淬灭荧光基团距离变远，淬灭荧光染料的抑制作用消失，报告 荧光信号得以释放出来而被仪器检测到，从而实现对亚欧型FMDV的检测。 优选地，本专利技术荧光PCR引物对扩增的靶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示，本专利技术的特异性荧光探针针对该引物对扩增区域中的GC高含量区，该探针的 5'端具有报告荧光染料标记，3'端具有淬灭荧光染料标记。更优选地，本专利技术亚欧 型FMDV特异性的正向引物序列为5 ' -TACCACYTTCCGCCTACTTG-3 '，反向引物序列为 5' -GGAAHGACGYAAAACTTAGG-3'，以及该引物对的正向引物向5'端延伸10个碱基、反向引 物向3'端延伸10个碱基所包括的DNA序列区域内得到的引物序列及互补序列；探针序列 为，5' -CGCTGTCTTGGGCACTCCYGTTG-3' ，5'端用报告荧光染料标记，3'端用淬灭荧光染料 标记。探针的反向互补序列为5' -CAACRGGAGTGCCCAAGACAGCG-3'以及该探针向5'端延 伸10个碱基、向3'端延伸10个碱基区域内得到的探针序列及互补序列。 亚欧型FMDV特异性的PCR引物和探针设计完成后，采用在线BLAST分析其序列特 异性。结果表明亚欧型FMDV特异性的引物和探针设计区域为亚欧型FMDV所特有，没有发 现同源或序列一致性生物基因信息，可以保证扩增产物的特异性。 在本专利技术的一个优选实验方案中，引物扩增产物长度为196bp，探针设计于待扩 增序列间的高GC含量区，该探针的5'端用报告荧光染料HEX标记，3'端用淬灭荧光染料 Eclipse标记。亚欧型口蹄疫病毒荧光PCR检测采用如下步骤进行 1)进行A、0、C以及Asia 1型口蹄疫病毒感染样本RNA的提取； 2)向经过处理的口蹄疫病毒RNA加入权利要求1所述引物对和荧光素标记探针以及PCR扩增用的dNTP、 PCR缓冲液、MgCl2、 ddH20及反转录酶、DNA聚合酶，制备PCR扩增反应液； 3)将装有PCR扩增反应液的PCR管置于荧光PCR仪上； 4)根据探针标记的报告荧光类型，选择对应的荧光通道，进行荧光PCR扩增，记录 各检测样本的PCR扩增循环数(Ct); 5)根据各样本的反应Ct值，按照阳性判定标准判定待检样本中是否存在亚欧型 口蹄疫病毒。 本专利技术的引物对和探针以及相应检测方法充分利用了荧光PCR技术的高效扩增 性、核酸杂交的良好特异性和荧光检测技术的快速敏感性，反应结束即时便可根据扩增曲线判定待检组织病料中是否含有亚欧型口蹄疫病毒。同时，本专利技术中PCR扩增所针对的基 因组区域，为亚欧型口蹄疫病毒特异性的序列，与南非型口蹄疫病毒无交叉反应，在获得良 好的特异性同时，通用性更强。附图说明 图1所示的是含有荧光PCR锚定DNA片断的重组质粒的PCR鉴定结果。图中M道 指DL-2000DNA Marker,本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于亚欧型口蹄疫病毒进行实时荧光ＰＣＲ检测的引物对，其特征在于，所述的引物对特异性扩增口蹄疫病毒基因组５′－ＵＴＲ序列的保守区域。
【技术特征摘要】
一种用于亚欧型口蹄疫病毒进行实时荧光PCR检测的引物对，其特征在于，所述的引物对特异性扩增口蹄疫病毒基因组5′-UTR序列的保守区域。2. 如权利要求1所述的引物对，其特征在于，该引物对扩增的靶基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1所示。3. 如权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列为正向引物5' -TACCACYTTCCGCCTACTTG-3'，或该序列向5'端延伸10个碱基所包括的DNA序列区域内 得到的引物序列；反向引物5' -GGAAHGACGYAAAACTTAGG-3'，或该序列向3'端延伸10个碱基所包括的 DNA序列区域内得到的引物序列。4. 一种用于亚欧型口蹄疫病毒进行实时荧光PCR检测的荧光素探针，其特征在于所述 探针特异性针对于权利要求1 3任一所述引物对扩增区域中的GC高含量区，该探针的5' 端具有报告荧光染料标记，3'端具有淬灭荧光染料标记。5. 如权利要求4所述的荧光素探针，其特征在于，该述针的核苷酸序列为 5' -CGCTGTCTTGGGCACTCCYGTTG-3'，或该序列向5'端延伸10个碱基、向3'端延伸10个 碱基区域内得到的探针序列，该探针的5'端具有报告荧光染料HEX标记，3'端具有淬灭荧 光染料Eclipse标记。6. —种对亚欧型...
【专利技术属性】
技术研发人员：林祥梅，吴绍强，韩雪清，梅琳，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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