肺癌分型的基因序列及其应用制造技术

本发明专利技术公开了用于肺癌基因分型的基因序列以及该基因序列的基因芯片。本 发明专利技术还公开了该基因序列用于肺癌样品基因分型的方法。本发明专利技术的用于肺癌分型 和诊断的基因序列可以快速高通量的筛选出与肺癌分子分型可能相关的基因，对 肺癌组织进行分子分型。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种进行肺癌病理分型的基因检测分析方法，属于分子生物学技 术应用领域。
技术介绍
肺癌在病理学上分为小细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌等几种类型， 在基本类型下还有多种亚型的区分。各病理类型的肺癌在肿瘤的生物学行为、对 放疗、化疗及分子耙向药物的敏感性等方面存在差异，各型预后也不相同。因此， 在临床上对肺癌作出诊断时，明确其病理分型对制订治疗方案、分析预后非常重 要。在本专利技术之前，医学界对肺癌的病理分型主要依靠微观形态学及免疫组织化 学方法。传统的病理组织学方法是将获取的病变组织通过固定、脱蜡、染色等步 骤，制作成切片在在显微镜下分辨其微观结构。该方法步骤繁多，需要白白等待 一二天的时间，在病理学专业人员对切片进行判读时也难免主观性。肿瘤的分子分型(molecular classification)是从系统生物学角度，采用 现代新型高通量分子分析技术，根据分子(分子遗传学、分子生物学)改变特征， 对肿瘤进行分类分型。分子分型既与组织形态学分型相关，又是对后者的积极补 充。现有关于肺癌的分子生物学知识认为，不同病理类型肺癌的基因表达谱不同， 即不同的基因在不同的病理组织有不同的丰度。 .DNA芯片或DNA微阵列，是通过微电子技术和微加工技术将大量特定序列的 DNA片段或寡核苷酸片段按矩阵高密度固定于玻璃、硅片等载体上，待测样品用 荧光分子标记后，与芯片上大DNA或寡核苷酸片段杂交，通过荧光扫描及计算机 分析后获得大量基因信息的一种检测方法，其突出特点在于能够对微量样本中的 核酸序列信息进行快速、准确、高通量的检测和分析，可以获得单个基因相关的 表达水平，及相似的或完全相同基因表达模式的表达谱。应用高通量cDNA芯片和寡核苷酸芯片技术建立的基因表达谱，在过去几年3里已经试验性的用于肿瘤诊断，这是一个革命性的变化。随着这些工具的应用， 以前不能明确的肿瘤亚群已经被确定。另外，基因信号的发展能够用来预测预后 的结论，这是从标准的组织病理学和免疫组织化学方法不能得出的，开拓了用病 理诊断分析肿瘤的途径。通过基因芯片应用实例，说明了这项技术应用范围的广 阔，甚至能提高组织病理学诊断预测能力。小细胞肺癌与非小细胞肺癌的基因表达谱明显不同构成鳞癌特症性表达 谱的基因大多参与细胞解毒和抗氧化过程(如GST、羧基酯酶等)，往往与支气管上皮细胞对环境致癌因素(如香烟成分)的代谢、解毒有关。而腺癌则以表面活性物质相关基因和小气道相关基因异常表达为特点(如Surfactants A2和B、 Mucin 1)，提示这类肿瘤的细胞起源及其发病机制。大细胞肺癌的特征性基因 表达谱，例如过表达HMGI (Y) 、 TPA等，以及低表达E-cad、 PAX-8和r-catenin 等，反映了上皮细胞-间充质细胞转分化。此外， 一部分被组织学诊断为大细胞 肺癌的病例，根据基因表达谱却可以清楚地归入鳞癌或腺癌组。真正有价值的正 是通过对基因表达谱分析，识别目前尚不能通过组织形态学加以区别，但却有临 床意义的肿瘤亚型。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供用于肺癌分型和诊断的基因序列，所述序列包括(a) SEQ ID NO 10至SEQ ID NO 323所示的序列;(b) SEQ ID NO 10至SEQ ID NO 323所示的序列中每条序列的互补序列;(c) 与SEQ ID NO 10至SEQ ID NO 323所示的序列中每条序列有至少70 %同源性的序列。本专利技术的目的之二是将基因序列用于肺癌分型和诊断领域，构建一种用于肺 癌基因分型的基因芯片。实现本专利技术第二个目的的一种用于肺癌基因分型的基因芯片，其构成包括固 定载体和固定在固定载体上的寡核苷酸探针，其中所述寡核苷酸探针包括(a) SEQ ID NO 10至SEQ ID NO 323所示的序列；(b) SEQ ID NO 10至SEQ ID NO 323所示的序列中每条序列的互补序列；(c)与SEQ ID NO 10至SEQ ID NO 323 所示的序列中每条序列有至少70%同源性的序列。所述寡核苷酸探针还包括选 自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 10的几种或全部阳性对照探针和阴性对照探针。本专利技术寡核苷酸基因芯片分为4个区，每个区域按18X17矩阵排列，每个 区含有9个阳性对照、5个阴性对照和3个空白对照。本专利技术的目的之三是提供一种肺癌样品，因分型的方法。该方法采用基因技 术筛选与肺癌分子分型相关的基因，对肺癌的基因分型诊断及肺鳞癌、肺腺癌内 亚型的细分诊断提供有价值的依据，为肺癌分子分型研究、实现肺癌病例个体化 治疗提供参考。实现本专利技术第三个目的的肺癌样品基因分型方法，包括以下步骤(1) 分别提取95D细胞s肺腺癌组织、肺鳞癌组织的总RNA,以总RNA逆 转录为cDNA，制作成有荧光标记的探针；(2) 上述制备的杂交荧光探针与芯片进行杂交，获得杂交结果；(3) 用ScanarrayLite激光共聚焦扫描仪扫描芯片，通过Gen印ix 5. 1分 析软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度和比值，其中Cy5/Cy3相差两倍以上 且比值大于2. 0或小于0. 5表示基因有差异表达，并采用聚类方法分别对肺鳞癌 和肺腺癌的基因表达谱进行相关性分析。本专利技术的用于肺癌分型和诊断的基因序列可以快速高通量地筛选出与肺癌 分子分型可能相关的基因，对肺癌组织进行分子分型，提供一定线索，为临床诊 断提供更多信息。附图说明图1为芯片各区01igo分布图。其中红色线框内是阳性对照，黄色线框内是 空白对照，蓝色线框内是阴性对照。在黑白图中红色是黑线，黄色和蓝色是白线； 图2为95D细胞总RNA电泳结果； 图3为95D2在芯片的Block2上的杂交结果；图3.1 (a) Cy3标记95D1 ， (b) Cy5标记95D2，在一张芯片杂交结果； 图3. 2(a) (b)均用Cy5标记的杂交结果； 图4为鳞癌、腺癌部分癌组织及癌旁组织总RNA电泳结果； 图4.1为同一鳞癌病人癌组织和癌旁组织总RNA电泳结果； 图4. 2为同一腺癌病人癌组织和癌旁组织总RNA电泳结果； 图5为鳞癌和其癌旁组织与芯片杂交结果，其中(a) Cy3-鳞癌癌旁组织， (b) 二者叠加图，(c) Cy5-鳞癌癌组织；5图6为腺癌和其癌旁组织与芯片杂交结果，其中(a) Cy3-腺癌癌旁组织，(b) 二者叠加图，(c) Cy5-腺癌组织；图7为(a)肺鳞癌与其癌旁组织、(b)肺腺癌与其癌旁组织散点图8为7例腺癌病人癌组织与芯片杂交结果，其中(a)Cy3-XI， (b)Cy3-X3，(c) Cy3—X5， (d) Cy5—X2， (e) Cy5—X4, (f) Cy5-X6， (g) Cy5-X7;图9为8例鳞癌病人癌组织与芯片杂交结果，其中(a)Cy3-Ll， (b)Cy3-L3， (c) Cy3—L5， (d) Cy5—L2， (e) Cy5—L4， (f) Cy5-L6， (g) Cy5-L7， (h) Cy5-L8;图IO为(a)肺鳞癌、(b)肺腺癌癌旁组织与芯片杂交结果；图11为8例肺鳞癌和7例肺腺癌与芯片非监督聚类图，其中X代表腺癌，L代表鳞癌，p代表癌旁组织，红色本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于肺癌基因分型的基因序列，其特征在于，所述序列包括：　（ａ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　１０至ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　３２３所示的序列；　（ｂ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　１０至ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　３２３所示的序列中每条序列的互补序列；　 　（ｃ）与ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　１０至ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　３２３所示的序列中每条序列有至少７０％同源性的序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈良安，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：11