本发明专利技术公开了一种ＩＬ１Ｒ１基因启动子区域中的ＳＮＰ位点、其确定方法及应用，该ＳＮＰ位点是首次发现的新位点，为ＩＬ１Ｒ１基因Ｔ／Ｃ多态，具有ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ．１所示的核苷酸序列，位于ＩＬ１Ｒ１基因启动子区域－１２５３位；其确定方法：提取宿主细胞的基因组ＤＮＡ；将模板ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，产物纯化；纯化后的ＰＣＲ产物进行ＤＮＡ测序，从而确定ＳＮＰ位点；其基因型确定法：提取宿主细胞的基因组ＤＮＡ；将模板ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，产物纯化；纯化后的ＰＣＲ产物进行ＰＣＲ延伸反应，树脂纯化；芯片点样后，质谱检测，进行数据分析，从而确定ＳＮＰ位点的基因型。本发明专利技术的ＳＮＰ位点可应用于冠心病方面。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种SNP(单核苷酸多态性)位点，特别是涉及一种IL1R1基因(IL-1 受体I型)启动子区域中的SNP位点、其确定方法及应用。
技术介绍
IL-1R I (I型)和IL-1R II (II型)是一类细胞膜受体，结构为一种只有一条多 肽链的跨膜蛋白，二者的细胞外部分具有同源性，含有3个免疫球蛋白样结构域，大约325 个氨基酸。其胞浆部分差异较大，IL-1R I由215个氨基酸组成，而IL-1R 1I只有29个氨 基酸。多数细胞同时具有IL-1R I、IL-1R II二种受体。IL-1 a与IL-1RI的结合亲和力 是IL-113与IL-1R I的10倍。IL-1通过与IL-1R I结合发挥其生物活性。IL-1R II也 称为"decoy"受体，IL-1与IL-1R II结合后不具有活性。转导IL_1剌激信号的主要是 IL-1R I/IL-lR-AcP(IL-lR accessory protein)复合物，而IL-1R II通过与IL-1R I竞 争结合IL-1起抑制作用。IL-4(Interleukin 4)通过诱导IL1R2基因的表达和释放，拮抗 IL-1的生物活性。IL1R1基因和IL1R2基因属于IL-1受体家族，与IL1RL1 (interleukin 1 rec印tor-like 1，ST2)禾口 IL1RL2 (inter—leukin 1 rec印tor—like 2)形成一个细胞因子 受体基因簇位于2q12。 对IL1R1基因缺失小鼠的研究发现1)IL1R1—/—小鼠不能应答IL-1的剌激，包括用 IL-1剌激不能诱导IL-6和E-选择素表达等，证实IL-1R I是IL-1 a和IL_1 P唯一的信 号传导受体；2)在感染或高脂饮食情况下，IL-1R I具有促进动脉粥样硬化斑块演变的作 用；3)机体内的IL-lRa表达和IL_1/IL_1R I结合之间存在一种平衡，通过这种平衡机制， 可调节机体对炎症的应答反应。新近发现，脂肪组织亦可表达IL-1R I和IL-lR-AcP。 目前，国内外对ILIRI基因与疾病相关性的研究很少。McCarthy等在一组出现代 谢异常症状的冠心病人群中研究发现，IL1R1基因多态与该人群代谢综合征的发生相关。但 Zee等在一项前瞻性研究中，未发现IL1R1基因多态(EX0N1B， T/C多态)与冠状动脉粥样 硬化的病变程度和经皮冠脉腔内血管成形术(PTCA术)后再狭窄的发生相关。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种IL1R1基因启动子区域中的SNP位点、其 确定方法及应用，为治疗或预防冠心病方面的研究开拓新的途径。 为解决上述技术问题，本专利技术的IL1R1基因(IL-1受体I型)启动子区域中的SNP 位点，是IL1R1基因启动子区域-1253位的T/C多态(cttttttttt (T/C) cctgtatttg)，具有 SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。 本专利技术的IL1R1基因启动子区域中的SNP位点的确定方法，包括步骤 1)提取宿主细胞的基因组DNA ; 2)将模板DNA进行PCR扩增，并将PCR产物纯化； 3)纯化后的PCR产物进行DNA测序，从而确定SNP位点。3 所述步骤2)中的PCR扩增引物和步骤3)中的测序引物都为上游3， -gcctggaactggtgattgg-5，，下游3， -cagcctgagtgacagagtgaga-5，。 本专利技术的IL1R1基因启动子区域中的SNP位点的基因型确定方法，包括步骤 1)提取宿主细胞的基因组DNA ; 2)将模板DNA进行PCR扩增，并将PCR产物纯化； 3)纯化后的PCR产物进行PCR延伸反应，树脂纯化； 4)芯片点样后，质谱检测，进行数据分析，从而确定SNP位点的基因型。 所述步骤2)中的PCR扩增的引物是上游3' -acgttggatggtctcgcatggttagaaaatc-5，，下游3， -acgttggatgccatctcaaaaaaaaaaaagg-5，；步骤3)中的延伸反应的弓l物是下游3' ltgctttttaaacaaatacagg-5'o 本专利技术的IL1R1基因启动子区域中的SNP位点(IL1R1基因启动子区域-1253位 的T/C多态)与冠心病、冠脉病变程度(冠状动脉粥样硬化病变程度)和脂代谢异常相关， 因此，通过对该基因多态的研究开发可用于冠心病方面，如控制冠心病发病、冠状动脉粥样 硬化病变程度或脂代谢异常。附图说明 图1是PCR扩增反应程序图。具体实施例方式( — )研究对象 1.侯选基因SNPs检测样本 24个没有亲缘关系的样本，冠心病确诊患者和健康对照各12例。 2.入选SNPs分型样本 1)冠心病组(CAD组) 来自上海交通大学医学院附属瑞金医院心内科病房，共286例，平均年龄 60. 57± 10. 37岁，冠心病诊断参照1979年WHO颁布的缺血性心脏病诊断标准，均经冠状动 脉造影确诊和/或有明确急性心肌梗死病史者。冠状动脉造影显示冠状动脉管腔狭窄> 70%的，诊断为冠状动脉病变；左主干管腔狭窄> 50%的，诊断为二支冠状动脉病变。排除 糖尿病、脑梗塞、免疫性疾病、神经系统性疾病、恶性肿瘤和肝肾疾患者。 2)正常对照组(CONTROL组) 来自上海交通大学医学院附属瑞金医院内科门诊和体检中心的健康体检，共202 例，平均年龄52. 83 ± 7. 70岁，经病史、体检、心电图等检查排除冠心病、高血压病、糖尿病、 脑梗塞、免疫性疾病、神经系统性疾病、恶性肿瘤和肝肾疾病患者。 3.目的片段PCR扩增 l)PCR反应体系(25ii 1) :10 X Buffer 2. 5 ii 1， dNTPmix (10mM) 0. 75 ii 1， MgCl2(25mM)2iil， Hotsta/ T叫DNA聚合酶(5U/iU， QIAGEN) 0. 3 yl，引物(上游 3， _gcctggaactggtgattgg_5，，下游3， _cagcctgagtgacagagtgaga_5， ， 10 li M) 0. 75 li 1 X 2， DNA模板(20ng/iU，白细胞中提取)1 P l，其余为双蒸水。 2)PCR反应程序95。C变性2min ;94。C变性30sec，62。C退火lmin，72。C延伸40sec，共35个循环；最后72。C延伸5min ;4"①。 4. PCR产物纯化(SAP和Exon I纯化) 纯化体系(7 ii 1) :PCR产物5 iil，虫下碱性磷酸酶(SAP, 7. 633U/ iU， ABI Biosystem)O. 16 ii l，外切酶(Exon I，20U/ii 1， ABI Biosystem)O. 25 ii l，其余为双蒸水。 纯化反应37。C孵育15min，80。C 15min。 5.测序反应(双向直接测序) 1)反应体系测序引物(0.8iiM)、PCR纯化产物和荧光测序MIX各2iil，其中测序 引物序列如同上述PCR扩增1)步骤中的引物序列。 2)PCR扩增反应 如图1所示。 3)乙醇沉淀 4)测序反应产物聚丙烯酰胺凝胶电泳在自动测序仪上进行48道本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种ＩＬ１Ｒ１基因启动子区域中的ＳＮＰ位点，其特征在于：是ＩＬ１Ｒ１基因启动子区域－１２５３位的Ｔ／Ｃ多态，具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘艳，金玮，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属瑞金医院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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