用于维持近交动物品系遗传稳定性的方法技术

本发明专利技术提供了维持非－人动物近交系遗传稳定性的新方法。该方法中，产生了源自原代群体的追踪－谱系的冷藏胚胎且以合适的时间间隔用于重建原代群体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于维持近交动物品系遗传稳定性的方法相关申请的交叉引用本申请要求2003年8月22日提交的美国临时申请60/497,451的优先权；此处全文引入该申请作为参考。政府基金此处所述工作完全或部分地由来自国家癌症研究所，NIH的拨款No.R01-GM020919资助。美国政府享有本专利技术的相应权利。
技术介绍
实验动物可用作研究人类疾病的有效模型。转基因和靶突变技术的发展使得小鼠不仅成为用于人基因组分析的成功的替代生物体，而且成为研究人类疾病的遗传学和发病原理最有价值的模型系统。对获自小鼠研究的实验结果的正确解释依赖于所用的小鼠模型是遗传上纯种并且明确界定的保证。为此，研究人员一般利用近交系用于试验，因为这些小鼠与远交小鼠原种不同，其提供基因型的均一性和恒定性。近交系小鼠可以纯合的实验个体重复获得，其具有可预计的表型和既定的等位基因组成。然而，由于新突变的出现以及与残留杂合性的连续等位基因固定的逐步积累，近交系小鼠中基因型的恒定性还未曾完全实现。近交小鼠内基因型的这些变化称作遗传漂变。在每个世代，都有自发新突变产生的可能性。这些突变最初以杂合突变存在。当近交系的两个原代碰巧成为一个自发突变的纯合子时，该突变就在该近交系中固定，随后所有该近交小鼠品系的后代将携带该突变。作为自发突变增长的结果，遗传漂变将影响对源自一个近交系的动物进行的遗传分析。对利用近交动物生成的实验数据的正确解释受到遗传漂变的破坏。最近的出版物例举了这一点。在2001，Specht和Schoepfer发现C57BL/6JOlaHsd小鼠中(参见Specht和Schoepfer，Deletion of the alpha-synuclein locus in a subpopulation of C57BL/6Jinbred mice，BMC Neurosci.2，11(2001))的染色体缺失。该突变为超过79kb的α-共核蛋白(synuclein)位点的切除。该基因编码突触前终脑蛋白，其与帕金森和阿尔茨海默疾病的病因有关。许多研究人员已将C57BL/6JOlaHsd小鼠作为野生型对照用于他们的实验或者与其他的突变体回交，而没有意识到该问题。现在他们的试验结果需要根据该品系中存在的α-共核蛋白缺失而重新评估。参见Wotjak，C57Black/Box？The importance of exact mouse strain nomenclature，Trends in Genetics 19183-184(2003)。此外，研究人员常常需要比较很长时期内获自近交动物的数据。由于遗传漂变的影响，随着时间的推移，在较早的时间点近交系小鼠变得在遗传上不同于“同样的”近交小鼠。时间间隔越长，则遗传学差异越可能积累且固定。遗传漂变的存在因此破坏了很长时期内进行有效比较的能力。为此，需要在近交动物品系中减少遗传漂变并且长时间维持其遗传稳定性。本领域中急需用于维持近交动物品系遗传稳定性的方法。在此提供了所述方法。专利技术概述本专利技术提供了维持非-人动物近交小鼠品系遗传稳定性的新的方法。在本专利技术中，维持了纯种原代群体用于获得近交小鼠品系。该近交小鼠品系的原代群体源自单一的兄妹交配个体。每年两次至四次，从该原代群体选择新的兄-妹配偶作为新的原代配偶以重建克隆。利用该方法，由于随着时间的过去在近交小鼠品系中自发突变的累积以及等位基因的固定，现今的原代群体将在遗传上不同于今后数年的原代群体。申请人设计了通过产生源自原代群体的冷藏胚胎的追踪-谱系的原种以及利用该原种以合适的时间间隔重建原代群体而限制近交小鼠的遗传漂变以及维持遗传稳定性的新方法。冷藏原种作为该原代群体的贮藏库且利用该冷藏原种定期重建原代群体降低了在既定时期内的世代数目且因此有效地降低了遗传漂变的实际比率。由于原种中每个胚胎的谱系是已知的，可以选择性地仅恢复兄-妹配偶的胚胎。因此，该近交小鼠品系通过连续的兄-妹交配，保持该小鼠品系完整的近交状态而繁殖。该方法可以合适的时间间隔重复，由此允许维持具有有限遗传漂变的近交小鼠品系而不影响该品系近交状态。通过获得和冷藏来自源自原代群体的兄-妹配偶的胚胎而产生冷藏胚胎的追踪-谱系的原种。可通过该兄-妹配偶交配而获得胚胎。可通过交配(性交)或通过体外或体内的人工方法产生胚胎。人工方法包括，但不限于，人工受精、体外或体内的成熟卵细胞的体外受精、胚胎移植、胞质内精子注射、无性繁殖、受精卵细胞的体外培养和胚胎分裂等等。该追踪-谱系的冷藏原种也可以是胚胎干细胞的原种、配子的原种或前-配子的原种。配子、前-配子或胚胎干细胞源自近交小鼠品系的原代群体。上述冷藏原种可用作原代群体的冷冻贮藏库以维持近交系的遗传稳定性。本专利技术提供了产生追踪-谱系的冷藏原种的方法以及利用该原种维持近交系遗传稳定性的方法。本专利技术还提供了冷藏的非-人动物胚胎、配子、前-配子或胚胎干细胞的追踪-谱系的原种。每个这些原种源自一个近交系的原代群体。追踪并记录每个品系各自胚胎、配子、前-配子或胚胎干细胞的谱系以允许在将来有选择的恢复。申请人进一步提供了遗传稳定的非-人动物近交小鼠品系，其通过此处所述方法制得。非-人动物可以是啮齿类，例如大鼠或小鼠。申请人进一步提供了用于进行提供遗传稳定的非-人动物近交系的业务的方法。根据本专利技术，原代群体用于近交系的维持，并且产生源自该原代群体的胚胎的追踪-谱系的冷藏原种。以合适的时间间隔，选择源自单一兄-妹配偶的兄-妹胚胎对且由该同胞胚胎产生活的动物。从产生的动物中选择兄-妹配偶且用作新的原代配偶以重建原代原种。根据顾客的要求，提供给顾客遗传稳定的近交小鼠品系的一个或多个动物。这些方法的进行使得有可能维持具有有限遗传漂变的近交系而不影响该品系的近交状态。因此，动物研究人员可得到具有长时期明确-界定基因型的真正遗传均一的近交动物，其非常有助于进行正确的数据解释和有价值的数据比较。附图简述该附图显示了生成足够数量源自原代群体的追踪-谱系的胚胎以产生用于维持近交系遗传稳定性的追踪-谱系的冷藏胚胎的示意图。专利技术详述本专利技术提供了维持非-人动物近交系遗传稳定性的新方法。如此处所述的，近交动物品系的遗传稳定性通过产生源自原代群体的追踪-谱系的冷藏胚胎并且以合适的时间间隔用此重建原代群体而维持。该方法的使用降低了既定时期内传代的次数并且因此降低了遗传漂变的风险。由于每个冷藏胚胎的谱系是已知的，可以选择性地仅恢复兄妹的胚胎，即源自相同父母。因此，该近交小鼠品系通过持续的兄-妹交配，保持该小鼠品系完整的近交状态而进行繁殖。I.利用冷藏胚胎维持遗传稳定性本专利技术提供了维持非-人动物近交系遗传稳定性的方法。在一个实施方案中，该方法包括(1)培养近交系的原代群体；(2)产生源自该原代群体的冷藏胚胎的追踪-谱系的原种；(3)以合适的时间间隔选择近交配偶的冷藏胚胎，并且从该胚胎产生活的动物；(4)从产生的动物中选择近交配偶对且利用该配偶作为新的原代配偶以产生该品系的动物；和(5)以合适的时间间隔重复步骤(3)至(4)。如此，该近交小鼠品系的遗传漂变减到最低程度并且该品系的遗传稳定性得以有效维持。如此处使用的术语″遗传稳定性″指和如果利用现行的方法维持近交系将出现的遗传漂变相比，近交系中的遗传漂变得以有效降本文档来自技高网...

【技术保护点】
维持非－人动物近交系遗传稳定性的方法，包括：（ａ）维持近交系的原代群体；（ｂ）产生源自该原代群体的冷藏胚胎的追踪－谱系的原种；（ｃ）从该追踪－谱系的原种的冷藏胚胎产生活的动物；（ｄ）从该活的动物中选择兄－妹配偶用于作为新的原代配偶以重建原代群体；（ｅ）以合适的时间间隔重复步骤（ｃ）至（ｄ），由此维持近交系的遗传稳定性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2003-8-22 60/497,4511.维持非-人动物近交系遗传稳定性的方法，包括(a)维持近交系的原代群体；(b)产生源自该原代群体的冷藏胚胎的追踪-谱系的原种；(c)从该追踪-谱系的原种的冷藏胚胎产生活的动物；(d)从该活的动物中选择兄-妹配偶用于作为新的原代配偶以重建原代群体；(e)以合适的时间间隔重复步骤(c)至(d)，由此维持近交系的遗传稳定性。2.权利要求1的方法，其中活的动物由追踪-谱系的原种的同胞胚胎产生。3.权利要求2的方法，其中非-人动物为啮齿类动物。4.权利要求3的方法，其中啮齿类动物为小鼠。5.权利要求4的方法，其中产生源自原代群体的冷藏非-人动物胚胎的追踪-谱系的原种的步骤包括(a)从原代群体的兄-妹配偶产生胚胎；和(b)冷藏(a)中产生的胚胎，其中追踪原种中每个胚胎的谱系使得每个冷藏胚胎具有确定的谱系，由此产生冷藏的胚胎原种。6.权利要求4的方法，其中产生源自原代群体的冷藏的非-人动物胚胎的追踪-谱系的原种的步骤包括(a)从非-人动物品系的原代群体获得子代，其中所述子代包括合适数目的兄-妹配偶；(b)从兄-妹配偶产生胚胎；(c)冷藏(b)中产生的胚胎，其中追踪原种中每个胚胎的谱系使得每个冷藏胚胎具有可确定的谱系，由此产生冷藏的胚胎原种。7.权利要求6的方法，其中通过如下步骤从兄-妹配偶产生胚胎(a)姊妹与兄弟交配，由此产生胚胎；和(b)采集胚胎。8.权利要求7的方法，其中的交配通过性交进行。9.权利要求7的方法，其中的交配通过人工受精进行。10.权利要求7的方法，其中的交配通过体外受精进行，其包括(a)从姊妹收集卵细胞；(b)从兄弟收集精子；(c)用(b)中收集的精子对(a)中收集的卵细胞受精，由此产生受精的卵细胞；和(d)在适于受精卵细胞发育为胚胎的条件下维持受精的卵细胞。11.权利要求10的方法，进一步包括从姊妹收集卵细胞之前使该姊妹超排卵。12.权利要求11的方法，其中将冷藏胚胎保藏在管中使得每个管包含源自单一兄-妹配偶交配获得的胚胎。13.权利要求10的方法，其中卵细胞受精的步骤通过胞质内的游动精子显微注射进行。14.权利要求6的方法，其中从兄-妹配偶产生胚胎包括(a)从姊妹分离卵巢；(b)在适于卵细胞体外成熟的条件下培养卵巢，由此产生体外成熟的卵细胞；(c)从兄弟收集精子；(d)用(c)中收集的精子对(b)中产生的体外成熟的卵细胞受精，由此产生受精的卵细胞；(e)在适于受精卵细胞发育为胚胎的条件下维持受精的卵细胞；和(f)采集胚胎。15.权利要求6的方法，其中从兄-妹配偶产生胚胎包括(a)从姊妹采集卵巢；(b)将卵巢亚-分为几部分，由此产生几个卵巢部分；(c)将每个卵巢部分植入切除卵巢的宿主雌性中，由此产生已受孕的宿主雌性；(d)从该受孕的宿主雌性收集卵细胞；(e)从兄弟收集精子；(f)用(e)中收集的精子对(d)中收集的卵细胞受精，由此产生受精的卵细胞；(g)在适于受精卵细胞发育为胚胎的条件下维持受精的卵细胞；和(h)采集胚胎。16.产生源自原代群体的冷藏的非-人动物胚胎的追踪-谱系的原种的方法，包括(a)从原代群体的兄-妹配偶产生胚胎；和(b)冷藏(a)中产生的胚胎，其中追踪原种中每个胚胎的谱系使得每个冷藏胚胎具有可确定的谱系，由此产生冷藏的胚胎原种。17.产生源自原代群体的冷藏的非-人动物胚胎的追踪-谱系的原种的方法，包括(a)从非-人动物品系的原代群体获得子代，其中子代包括合适数目的兄-妹配偶；(b)从兄-妹配偶产生胚胎；(c)冷藏(b)中产生的胚胎，其中追踪原种中每个胚胎的谱系使得每个冷藏胚胎具有可确定的谱系，由此产生冷藏的胚胎原种。18.维持非-人动物近交系遗传稳定性的方法，包括(a)从源自原代群体的追踪-谱系的原种的冷藏胚胎产生活的动物；(b)从(a)中产生的活的动物选择兄-妹配偶用作新的原代配偶以重建原代群体；(c)以合适的时间间隔重复步骤(a)至(b)，由此维持近交系的遗传稳定性。19.权利要求18的方法，其中活的动物从追踪-谱系的原种的同胞胚胎产生。20.权利要求19的方法，其中非-人动物为啮齿类动物。21.权利要求20的方法，其中啮齿类动物为小鼠。22.冷藏的非-人动物胚胎的追踪-谱系的原种。23.权利要求22的原种，其中的非-人动物为啮齿类动物。24.权利要求23的原种，其中啮齿类动物为小鼠。25.提供具有有限的遗传漂变的非-人动物近交系的方法，包括(a)维持近交系的原代群体；(b)产生源自该...

【专利技术属性】
技术研发人员：迈克尔V维莱斯，罗伯特塔夫脱，伊娃M艾歇尔，
申请(专利权)人：杰克逊实验室，
类型：发明
国别省市：US[美国]