本发明专利技术公开了一种抗人ＴＮＦα单克隆抗体，其轻链氨基酸序列为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３，重链氨基酸序列为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４。本发明专利技术还进一步公开了上述抗人ＴＮＦα单克隆抗体的Ｆａｂ抗体，此外，本发明专利技术采用ＰＥＧ化和纳米技术等方法体外改造和修饰，获得了ＰＥＧ化的抗体及ＰＥＧ化抗人ＴＮＦ α单克隆抗体纳米颗粒，并进一步公开了上述抗体或抗体纳米颗粒的应用。本发明专利技术提供的抗ＴＮＦ单克隆抗体为全人抗体序列，免疫原性低，副作用小，生产成本低，采用纳米粒子制备技术，表面改性技术以及与小分子抗体桥联等技术延长实现了在体内缓释的目的，避免了小分子抗体半衰期短的缺点，在保持其抗ＴＮＦ活性的同时，使之更适合体内应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术及医药领域，具体涉及抗人TNFa单抗及其PEG化纳米颗粒及其 应用。
技术介绍
自身免疫性疾病是继癌症和心血管疾病的第三大类疾病。类风湿性关节炎(RA)是最 常见的自身免疫病之一，我国类风湿关节炎患病率约为0.32-0.36%，在60岁以上人群发病 率高达30% 40%。面对每人每年几十万元的进口药物治疗费用，患者往往只能长期忍受 痛苦的化学治疗，却又收效甚微。RA的患病人群多，用药量大，使其治疗性药物的市场巨大，2005年全球市场达到60 亿美元。目前临床治疗RA的方案很多，首选用大剂量非甾体抗炎药可控制症状，如无效， 则临床首选氨甲蝶呤等免疫抑制药治疗。约四分之一的患者首次发病后经及时治疗可终生 不再复发，约二分之一的患者经治疗后症状暂时得以缓解，但仍会反复发作，部分最终发 展为关节功能障碍；约四分之一的患者对目前所有的常规治疗均无效。肿瘤坏死因子-a (TNF-ci )是类风湿性关节炎病变过程中起主要作用的细胞因子，实 验和临床结果均证实TNF是治疗该病的适合靶点。国外对RA的发病机理进行了充分的研究， 发现肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor alpha, TNF-a)在该疾病的病理进程中起十 分关键的作用，患者或动物模型病变关节腔内的TNF水平异常升高。TNFoc和TNFp是哺乳动 物细胞中的一类同源分泌型蛋白质，它们相互之间具有很高的同源性，二者都可以对许多 细胞类型造成多方面的影响。这两种蛋白都可以通过与细胞膜上的受体作用而影响细胞的 生物学功能。肿瘤坏死因子TNFot能够引起肿瘤组织出血坏死并具有多方面功能。成熟分子 由157个氨基酸组成，含有两个二硫键，没有糖基化位点。其前体为233个氨基酸组成的 多肽，N-端76个氨基酸组成的多肽不是信号肽，它可以把前体固定在细胞膜上，使成熟的 分泌型保留在细胞膜上。前体的成熟mRNA长度为1.7kb。在体内主要由单核巨噬细胞产生。针对TNF-a的抑制剂成为迄今为止最为成功的RA治疗药物。代表药物如3Wyeth/Amgen公司Enbrel(etanercept)， Johnson & Johnson, Schering Plough/Centocor公司 Remicade(infliximab)， Cambridge Antibody Technology/Abbott的Humira(adalimumab)。 Enbrel 为Amgen公司开发的制剂，是TNF-a受体和Fc的融合蛋白，不仅对风湿性关节炎有非常 不错的疗效，且对牛皮癣及牛皮癣型关节炎也有明显的治疗作用，同时在促进脊椎炎愈合 的研究上，Enbrel也进入了二期临床。2004年销售额是25亿美元，预计2008年可达34亿 美元。Remicade是一种人鼠嵌合性的抗TNF-a单克隆抗体，可特异性结合可溶性及膜结合 型TNF-a，其适应症包括Crohn，病，风湿性关节炎(RA)，重症强直性脊柱炎(AS)。在 2003年和2004年全球销售额分别是22.7亿和28.9亿美元，是生物医药领域的重磅炸弹。 2002年12月Abbott公司的Humim成为第一个获准用于减轻成人中到重度活动期RA的病 征和症状及抑制关节结构损伤进展的全人单克隆抗体。由于是全人抗体，避免了 Remicade 会产生免疫反应的缺点。Humira与Remicade及Enbrel相比的另一个优势是给药方法的便 利上。Humira每月只需注射两次，而Remicade和Enbrel必须每周注射两次。Humira市场 占有率正逐年提高，2003年和2004年的销售额分别是2.8亿和8.5亿美元。这三个代表药物的疗效均比较确定，并且随着大规模临床试验的不断开展，除RA以 外的克隆氏病、强直性脊柱炎、银屑病等其他自身免疫病也相继成为新的适应症，使其市 场更加庞大。这些生物产品的特异性高，靶向性好使其副作用较其他同类药物明显降低， 逐渐地与甲氨蝶呤合用作为RA的一线用药，并增强它们对目前中至重度的风湿性疾病等 其他自身免疫病市场的渗透。目前处于开发末期阶段的新药主要有UCB/Celltech公司的 CDP-870 (PEG化人源化抗TNF抗体Fab片段)和CDP571 (人源化抗TNF单抗)，Bristol —Myers Squibb公司的CTLA41g (Abatacept)， Roche公司的Rituxan和MRA等。其中进展 最迅速的是CDP-870,目前已经进入临床III期，预计CDP-870于2006年底进入市场， CDP-870应用大肠杆菌进行生产，使其成本降低至其他TNF抑制剂药物的四分之一。虽然现有的TNF抗体类药物被认为较其它任何药物的效果都好，但它们也存在很大的 缺点。第一，它们均来自哺乳动物细胞表达和纯化，由于表达水平较低和生产能力有限远 远不能满足市场的需求，即便是Amgen斥资5亿美金创建了全球最大的20,000升细胞培养 生物反应器，这一问题依然存在(据2004年美国biopharma报告)；第二，这些抗体的高昂 成本使很大一部分患者被拒之门外，据估计，常规应用Enbrel、 Remicade和Humira治疗 RA—年的费用分别是11400、 14200和16776美金，且需反复使用(据2004年美国biopharma 报告)；第三，这些抗体所携带的Fc段具有结合补体和ADCC等活性，体内应用会导致表达TNF的细胞的凋亡，会产生一系列副作用;第四，Remicade是人鼠嵌合性单抗，含有 1/3的鼠源蛋白成分，连续注射可以在10%以上的病人中激发人抗鼠源蛋白抗体反应或人抗 嵌合蛋白抗体反应，影响治疗效果并可能导致严重的不良反应。即将上市的CDP870是PEG 化人源化抗TOF抗体Fab段[17]，其鼠源蛋白成分下降到10%，但仍然有免疫原性。而 Humir的可变区的氨基酸序列和相应的DNA序列来自于CAT公司开发的人源抗体库，其Fc 片段的编码区来自人的IgGl。由此可见，该产品的可变区序列并非直接来自人，而是来自 起源于人B细胞的抗体库。此外，虽然人类免疫系统能够产生种类极其庞大的抗体，但是人或全人抗体技术却遇 到了瓶颈人体内产生特异性抗体的前体细胞丰度很低，即使在抗体阳性的个体中，能够 产生特异性抗体的前体细胞也远远低于人杂交瘤技术所需要的能够产生特异性抗体细胞数 量。因此，分离、纯化和富集特异性分泌抗体的B细胞成为建立全人抗体平台的关键技术 之一。
技术实现思路
本专利技术建立了可以将能够分泌抗体的目的B细胞分离、纯化、富集和增殖的技术。B细 胞亚克隆后所分泌抗体的特异性可以通过ELISPOT、 ELISA等手段进行筛选和鉴定。从单克 隆培养的细胞株中获取目的抗体的基因序列，用以构建原核或真核表达载体，表达后即可 重建抗体的活性。本专利技术既是利用该平台从类风湿关节炎病人体的B细胞中获得抗人TNF a单克隆抗体，原核表达Fab和scFv小分子抗体，发酵、纯化后，采用聚乙二醇化(PEG 化)和纳米技术等方法体外改造和修饰，在保持其抗TNF活性的同时，使之更适合体内应 用。本专利技术一方面公开了一种抗人TNFct单克隆抗体，其轻链氨基酸序列为SEQ ID N0:本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗人ＴＮＦα单克隆抗体，其轻链氨基酸序列为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３或其保守型变异序列，重链氨基酸序列为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４或其保守型变异序列。
【技术特征摘要】
1.一种抗人TNFα单克隆抗体，其轻链氨基酸序列为SEQ ID NO3或其保守型变异序列，重链氨基酸序列为SEQ ID NO4或其保守型变异序列。2. 如权利要求1所述抗人TNFa单克隆抗体，其特征在于，所述抗人TNFa单克隆抗体被 PEG化。3. 如权利要求1或2所述抗人TNFa单克隆抗体在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。4. 如权利要求1所述抗人TNF a单克隆抗体的Fab抗体。5. 如权利要求4所述抗人TNF a单克隆抗体的Fab抗体，其特征在于，所述Fab抗体被PEG化。6. 如权利要求4或5所述抗人TNFa单克隆抗体的Fab抗体在制备治疗自身免疫性疾病药 物中的应用。7. —种PEG化抗人TNF a单克隆抗体纳米颗粒，为表面偶联PEG化抗人TNF a单克隆抗体 或其...
【专利技术属性】
技术研发人员：倪健，
申请(专利权)人：苏州工业园区晨健抗体组药物开发有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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