基于新型ＤＮＡ结合染料的实时荧光定量ＰＣＲ检测方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种基于新型ＤＮＡ结合染料的实时荧光定量ＰＣＲ检测方法及其应用。该方法是以ＳＹＴＯ为荧光染料进行的实时荧光定量ＰＣＲ检测方法。实验结果显示，ＳＹＴＯ家族的染料比ＳＹＢＲ？Ｇｒｅｅｎ？Ｉ更适用于荧光染料实时定量ＰＣＲ反应，染料可以在一个很宽的浓度范围内使用，ＤＮＡ熔解曲线不受ＤＮＡ浓度影响。表明本发明专利技术的实时荧光定量ＰＣＲ检测方法明显优于现有的实时荧光定量ＰＣＲ检测方法，具有对ＰＣＲ反应的抑制效应小、可用浓度范围大、序列结合偏性小、敏感性高等优点，适合大面积推广和应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种PCR检测方法及其应用，特别是涉及一种基于新型DNA结合染料 的实时荧光定量PCR检测方法及其在制备实时荧光定量PCR检测试剂盒中的应用。
技术介绍
1996年，实时荧光定量PCR技术由美国Applied Biosystems公司首先推出。所谓 实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指数扩增期间通过连续监测 荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化来即时分析目的基因的拷贝数目，通过与加 入已知量的标准品进行比较，可实现实时定量检测。实时荧光定量PCR技术实现了 PCR从 定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应 等优点成为了分子生物学研究中的重要工具。 目前，根据实时荧光定量PCR所使用的荧光化学物质的不同，荧光定量PCR技术主 要分两类，荧光染料和荧光探针。其中荧光探针包括T叫man探针、分子信标、FRET探针、蝎 式探针等。荧光染料主要包括Y0-PR0-1、 SYBR Green 1、BEB0和LC Green等。荧光染料 定量PCR的优势在于它使用方便，不需要设计复杂的荧光，使检测方法变得简便，同时也降 低了检测的成本。而且，它能监测任何双链DNA序列的扩增，没有引物特异性，可以用于不 同的模板。然而，正是由于荧光染料能和任何双链DNA结合，因此它也能与非特异的双链 DNA(如引物二聚体)结合，使实验容易产生假阳性信号。引物二聚体的问题目前可以用熔 解曲线(melting curve)加以解决，来区分特异性和非特异性扩增。因此，作为一种方便快 捷的定量PCR方法，荧光染料定量PCR应用非常广泛。 SYBR Green I因为其毒性低、价格便宜，成为最常使用的一种定量PCR荧光染料。 但是，SYBR Green I也存在一些明显的不足。例如，在未进行优化之前不能用于普通PCR缓 冲液中，并且需要额外的试剂(如DMSO、 BSA等)来增加反应的效率。尽管通过提高MgCl2 的浓度可以在一定程度上减小其抑制效应，但SYBR Green I仍可以浓度依赖的方式抑制 PCR反应。这种抑制效应可能是由于染料的分解产物所致。目前，SYBRGreen I已被广泛应 用于病原的检测。但是，利用该染料所做的熔解曲线(Tm)可受到染料和DNA浓度的影响。 例如，3倍浓度的起始DNA的差异，就可能引起1度的Tm值的变化。SYBR Green I的另一 个缺点是在多重PCR中应用有限。研究发现，进行双重PCR扩增时，熔解曲线只能检测到一 个产物，而电泳分析可以明显观察到两个产物。这个可能与扩增DNA和染料的相对浓度有 关。尽管SYBR Green I的应用范围较广，但是存在染料可用浓度范围小、序列结合偏性大 等缺点。 SYTO家族的染料是一种比较常见的DNA结合染料，它具有很多特性，包括膜通透 性、低细胞毒性、结合DNA后荧光增强等，这些特性使得它们适合于标记活细胞。但是它们 对双链与单链DNA的特异性结合能力不清，或者说它们作为定量PCR的染料是否合适仍不清楚。
技术实现思路
本专利技术提供了一种对PCR反应的抑制效应小、可用浓度范围大、序列结合偏性小、敏感性高的新型DNA结合染料，并建立了基于该染料的实时荧光定量PCR检测方法。 为解决上述技术问题，本专利技术采取以下技术方案一种基于新型DNA结合染料的实时荧光定量PCR检测方法，是以SYTO为荧光染料进行的实时荧光定量PCR检测方法。 所述SYTO荧光染料优选为SYT082 。 所述SYTO荧光染料的浓度优选为2 ii M。 所述PCR反应体系优选为10XPCR缓冲液2. 5iU， dNTP(2. 5mM)2ii1，MgCl2(25mM)2iil，上游引物(lOyM) :0. 5iU，下游引物(10iiM) :0. 5iU， rTaq酶(5U/ii 1) :0. 125 ii 1，模板DNA :1 ill (含1. OX 101 109拷贝)，染料1 y 1，加水补齐至终体积25ii 1。所述实时荧光定量PCRPCR反应条件优选为预变性94°C 3min ;扩增95°C 30s，52°C 30s，72。C 30s，共40个循环；72。C lOmin。 所述实时荧光定量PCR检测方法可包括以下步骤 1)将SYTO为荧光染料加入上述PCR反应体系中； 2)按上述反应条件进行PCR反应。 本专利技术的第二个目的是提供一种实时荧光定量PCR检测试剂盒。 本专利技术所提供实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括10XPCR缓冲液2. 5iU、dNTP(2. 5mM)2ii 1、 MgCl2 (25mM) 2 ii 1、 rTaq酶(5U/ii 1)0. 125 ii 1和荧光染料，所述荧光染料为SYTO荧光染料。 所述SYTO荧光染料优选为SYT082 。 所述SYTO荧光染料的浓度优选为2 ii M。 本专利技术提供了一种基于新型DNA结合染料的实时荧光定量PCR检测方法。以SYT082为例，探讨了 SYTO染料结合DNA的特性及其在定量PCR中应用的可行性。结果显示，SYTO家族的染料比SYBR Green I更适用于荧光染料实时定量PCR反应，染料可以在一个很宽的浓度范围内使用，DNA熔解曲线不受DNA浓度影响。这是因为l)SYTO染料的PCR抑制效应小。2)比较不同浓度的染料对熔解曲线的影响，结果SG染料只有3个浓度下的扩增产物有熔解曲线，而SYTO染料除了一个最低的浓度外，其余都能分析出熔解曲线。Tm值是分析扩增产物特异性的一个关键步骤，SG的结果显示，在不同染料浓度下，产物的Tm值有1度的差别，而SYTO染料则保持不变，说明不同浓度的SYTO染料对Tm值没有影响。另外，SG熔解曲线的宽度较SYTO的宽，说明SYTO结合到DNA随温度变化明显，特别是在产物解链的过程中，染料可迅速从双链中解离下来。3)选择SG染料的浓度为0. 25 ii M， SYTO染料的浓度为2uM，在该条件下扩增系列稀释模板，PCR结果显示，随着模板量的减少，扩增产物也减少，对应的荧光值也降低，表明SYTO的荧光值能够反映产物量的变化。从结果中我们观察到，在产物量的变化相同的情况下，SYTO荧光值的变化较SG大，这可能是因为SYTO结合DNA后荧光强度本身就要强一些，因此，相同的DNA变化程度将会导致产生更大的荧光值变化。从这一点可以推测，SYTO能够更为准确的对起始模板进行定量。4)线性范围是衡量定量PCR方法的一个指标。通过对系列稀释的模板进行PCR扩增，结合扩增曲线和Ct值4的变化，确定了 SG和SYTO的线性定量范围，结果显示，它们具有相同的定量范围，即103 108拷贝，这与报道的其它荧光染料定量PCR的线性范围一致。5)利用染料法定量PCR进行多重PCR扩增，需要通过最后的熔解曲线来鉴别多重PCR扩增的效果。结果显示通过熔解曲线的分析可以区分多个PCR扩增产物，虽然SYTO染料也存在一定的偏性，但是这种偏性远远小于SG。据此推测，利用SYTO染料进行多重PCR将具有较好的效果。上述实验结果表明本专利技术的实时荧光定量PCR检测方法明显优于现有的实时荧光定量PCR检测方法，具有对PCR反应的抑制本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于新型ＤＮＡ结合染料的实时荧光定量ＰＣＲ检测方法，是以ＳＹＴＯ为荧光染料进行的实时荧光定量ＰＣＲ检测方法。

【技术特征摘要】
一种基于新型DNA结合染料的实时荧光定量PCR检测方法，是以SYTO为荧光染料进行的实时荧光定量PCR检测方法。2. 根据权利要求1所述的PCR检测方法，其特征在于所述SYTO荧光染料为SYT082。3. 根据权利要求1所述的PCR检测方法，其特征在于所述SYTO荧光染料的浓度为 2iiM。4. 根据权利要求1所述的PCR检测方法，其特征在于所述PCR反应体系为IOXPCR 缓冲液2. 5iU， dNTP(2. 5mM)2ii1， MgCl2 (25mM) 2 yl，上游引物(10 y M) 0. 5 yl，下游引物 (10iiM)0. 5ii l，rTaq酶(5U/ii 1)0. 125 ii l，模板DNA(含1. 0X101 109拷贝)1 ii l，染料 1 iil ，加水补齐至终体积25 iil 。5. 根据权利要求1至4任一项所述的PCR检测方法，其特征在于所述PCR反应条件 为预变...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈泽良，王玉飞，钟志军，徐杰，杜昕颖，汪舟佳，孙岩松，黄留玉，
申请(专利权)人：中国人民解放军疾病预防控制所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]